心臓電気生理学、不整脈原性Ex Vivo蛍光システムで心臓内のニューロンの影響
1Department of Cardiology-Electrophysiology, cNEP (cardiac Neuro- and Electrophysiology research group), University Heart Center,University Hospital Hamburg-Eppendorf, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research), 3Institute of Experimental Cardiovascular Research,University Medical Center Hamburg-Eppendorf
Summary
ここでは、心臓内の自律神経系の変調とその基本的な電気生理学、不整脈原性、および前のヴィヴォ蛍光セットアップを使用してキャンプのダイナミクスに及ぼす影響の評価のためのプロトコルを提案する.
Abstract
遅く 19 世紀の発明、以来心臓灌流システム前のヴィヴォ蛍光が生理学的、生化学的、形態学的、および薬理学的パラメーターの広範なスペクトルを勉強に関連するツールであり続けます集中的に除神経心。ここでは、心腔内の自律神経系の変調とその基本的な電気生理学、不整脈原性、および環状アデノシン一リン酸 (cAMP) の動態に及ぼす影響の評価のためのセットアップをについて説明します。心臓内の自律神経系はどのマウス大脳基底核が主にあるパッドの心房の脂肪の機械的解離によって調節 — またはターゲットと同様、世界的な薬理学的介入法を用いた。右心房、右心室 octapolar 電気生理学的カテーテルが導入され、高解像度マッピングの心外膜に配置された多電極アレイ (MEA) が心臓電気生理・不整脈原性を決定するために使用されます。蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) をイメージング心臓各地のキャンプ レベルのリアルタイム監視が実行されます。Neuromorphology は全体心を同定と実行の研究で心臓自律神経系の特定のターゲットの変調をガイドする神経細胞のマーカーを使用して抗体を用いた染色を用いて検討しました。前のヴィヴォ蛍光セットアップは短時間で再現性のある実験の数が多いためことができます。セットアップの部分的オープンな性質にもかかわらず、(e.g。、MEA 測定中に) 一定の温度コントロールが難しく、最小限に抑える必要があります。この説明法分析し、分散心の心臓自律神経系を調節することが可能になります。
Introduction
心臓灌流システム前のヴィヴォ蛍光が生理学的、生化学的、形態学的、広範囲の実行に関連するツールであり続けます、薬理学的研究に集中的に横隔膜心1,2 ,3,4,5後半の 19th世紀6の発明以来。様々 なトピックの日には、このシステムはまだ広く使用されます (e.g。、虚血再灌流) または勉強する心の薬理学的効果を7、8、と心血管研究に基本的なツールであります。このメソッドの寿命に起因するいくつかの利点 (e.g。、中枢神経系または他の臓器、全身の循環やホルモンの影響を受けずに測定が実行されます)。必要な場合、医薬品を制御された方法で灌流バッファーに追加または特定の構造を直接適用できます。、再現可能な実験と実験数が比較的多いが短時間で実行できます。セットアップの部分は () のオープンな性質は、体温調節困難とを考慮する必要があることができます。小さい動物を主に使用する実験装置はより複雑より生物学的変動と蛍光システムはより大きい種9で使用されても、(例えば。、トランスジェニック マウス モデル) 使用することができます。
このプロトコルの実験のセットアップ、環状アデノシン一リン酸 (cAMP) ダイナミクス、心外膜伝導心室不整脈原性基本的な電気生理学的パラメーターに及ぼす心臓自律神経系は、します。評価されます。心房の脂肪パッドの中心に位置する、中央の神経支配から独立した心臓電気生理学を制御する知られている今、心臓内の節の数が多い、そのまままたは慎重な機械と手動で削除された左郭清。自律神経系の薬理学的変調は、グローバルに医薬品を灌流バッファーに追加することによって、または心房基底核のターゲット変調によるローカルに実行されます。実験の後、心は、免疫組織学的評価に適してすべての血液細胞は、染色の品質を高めることができる持続灌流により削除されています。
記載された方法の全体的な目標は、心臓電気生理学、不整脈原性マウスの心臓の自律神経系の影響についての詳細な研究の新しい視点を提供することです。このテクニックを使用する理由は研究し、自律神経系中枢神経系の影響を与えずに変更することが可能です。主要な利点の 1 つは潜在的なプロまたは不整脈プロパティの古いの薬理学的実験の簡単な雇用、新しいエージェントをテストすることができます。さらに、さまざまな心臓病のトランスジェニック、ノックアウト マウス モデルは代謝性疾患や心不全、不整脈の基になるメカニズムを調査承ります。このアプローチは、心房レベルで自律神経が心室の心臓電気生理・不整脈の誘発に影響する可能性がどのように理解を高めた。
Protocol
動物を含むすべてのプロシージャは、ハンブルク州立、ハンブルク大学のアニマル ・ ケアおよび使用委員会の地方自治体によって承認されました。 1. 蛍光装置の準備 注: 市販蛍光灌流システムが使用されます。 変更された促進ソリューション (119 mM 塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム一塩基、硫酸マグネ…
Representative Results
2 多電極アレイ (Mea) を含む蛍光セットアップのイメージを図 1に示します。実験前に、心臓内のカテーテルを右心房・右心室の速く、容易な挿入を容易にして、平衡が開始できるまでに短い期間を確保するためカニューレの近くに位置します。商工会議所の下の部分を高め (図 1の矢印を参照) ので、商工会議所が完全に閉?…
Discussion
別のマッピングと刺激テクニックによる心臓電気生理学、不整脈原性心内ニューロンの影響を研究するためのツールとして本稿では、よく知られている蛍光前のヴィヴォ心臓灌流システムを提案します。心内膜と心外膜アプローチを含みます。
プロトコルのいくつかの部分は、セットアップのために重要です。まず、心房の脂肪パッドはそのまま、または心筋を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼の優秀な技術支援とウケ顕微鏡イメージング施設 (Umif) の大学エッペンドルフ メディカル センター ハンブルク顕微鏡およびサポートを提供するためのハートウィグ目下を感謝したいです。本研究では資金によって Förderverein デ Universitären Herzzentrums ハンブルク e. v.、DZHK (ドイツ語心血管研究センター) [FKZ 81Z4710141]。
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET | |
References
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Cite This Article
Jungen, C., Scherschel, K., Bork, N. I., Kuklik, P., Eickholt, C., Kniep, H., Klatt, N., Willems, S., Nikolaev, V. O., Meyer, C. Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System. J. Vis. Exp. (135), e57617, doi:10.3791/57617 (2018).