Kardiyak Elektrofizyoloji ve Arrhythmogenesis bir Ex Vivo Langendorff sisteminde intrakardiyak nöronların etkisi
Summary
Burada, bir iletişim kuralı modülasyonu intrakardiyak otonom sinir sistemi ve temel Elektrofizyoloji, arrhythmogenesis ve ex vivo Langendorff kurulumu kullanarak kamp dinamikleri üzerindeki etkisi değerlendirilmesi için mevcut.
Abstract
Geç 19 yy onun icat beri Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi fizyolojik, biyokimyasal, morfolojik ve farmakolojik parametrelerinde geniş bir yelpazede eğitim için uygun bir araç olmaya devam ediyor Merkezi olarak denervated kalpler. Burada, modülasyon intrakardiyak otonom sinir sistemi ve temel Elektrofizyoloji, arrhythmogenesis ve siklik adenozin monofosfattır (kampı) dinamikleri üzerindeki etkisi değerlendirmesi için bir Kur açıklayın. İntrakardiyak otonom sinir sistemi tarafından hangi fare gangliyon bulunduğu esas olarak atriyal yağ yastıkları diseksiyon mekanik modülasyonlu — veya küresel yanı sıra hedeflenen farmakolojik müdahalelerin kullanımına göre. Bir octapolar elektrofizyolojik kateter sağ atriyumu ve sağ ventrikül tanıtıldı ve epicardial yerleştirilen çoklu elektrot dizilerin (MEA) yüksek çözünürlüklü eşleme kardiyak Elektrofizyoloji ve arrhythmogenesis belirlemek için kullanılır. Imaging Förster rezonans enerji transferi (FRET) kamp düzeyleri farklı kalp bölgelerdeki gerçek zamanlı izlenmesi için gerçekleştirilir. Neuromorphology aracılığıyla boyama kılavuzu tanımlama ve modülasyon gerçekleştirilen çalışmalarda intrakardiyak otonom sinir sisteminin belirli hedefleri için nöronal işaretçileri kullanarak tüm kalplerin antikor tabanlı incelenmiştir. Ex vivo Langendorff Kur tekrarlanabilir deneyler kısa bir süre içinde çok sayıda olanak sağlar. Yine de, kısmen açık yapısı yapısı (Örn., MEA ölçümler sırasında) sabit sıcaklık kontrolü zor hale getirir ve minimumda tutulmalıdır. Açıklanan bu yöntemi analiz ve adem-i merkeziyetçi kalpler intrakardiyak otonom sinir sisteminde modüle olanak sağlar.
Introduction
Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi fizyolojik, biyokimyasal, morfolojik geniş bir yelpazede gerçekleştirmek için ilgili bir araç olmaya devam etmektedir ve hearts1,2 denervated merkezi olarak Farmakolojik çalışmalar beri onun buluşu geç 19inci yüzyıl6‘ ,3,4,5 . Bugüne kadar bu sistem hala yaygın olarak çeşitli konular için kullanılır (Örn., iskemi reperfüzyon) veya çalışmaya kalp farmakolojik etkileri7,8ve kardiyovasküler araştırma temel bir araçtır. Uzun ömürlü bu yöntemin sonuçları çeşitli yararları (Örn., ölçümleri merkezi sinir sistemi veya diğer organları, sistemik dolaşımı veya dolaşan hormon etkisi gerçekleştirilir). Gerekirse, eczacılık denetimli bir biçimde perfüzyon arabelleğe eklenemez veya belirli yapılara doğrudan uygulanan. Deneyler tekrarlanabilir ve deneyler nispeten yüksek bir dizi kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Belgili tanımlık tertibat (kısmen) açık yapısı sıcaklık regülasyonu zor ve dikkate alınması gereken yapabilirsiniz. Langendorff sistem daha büyük tür9‘ da kullanılsa da daha az karmaşık ve büyük bir biyolojik çeşitliliğine deneysel Kur olduğu gibi daha küçük hayvanlar öncelikle kullanılır (Örn., transgenik fare modelleri) kullanılabilir.
Bu iletişim kuralı deneysel kurulumunda, intrakardiyak otonom sinir sisteminin temel elektrofizyolojik parametreleri, ventriküler arrhythmogenesis, epicardial ve tel ve siklik adenozin monofosfattır (kampı) dynamics biri olarak değerlendirildi. Ya bozulmamış veya el ile kaldırıldı dikkatli makine ile sol atriyal yağ yastıkları esas olarak bulunan ve şimdi kardiyak Elektrofizyoloji merkezi sinir denetiminden bağımsız kontrol etmek için bilinen, intrakardiyak gangliyon, çok sayıda vardır diseksiyon. Farmakolojik bir modülasyon otonom sinir sisteminin genel olarak perfüzyon arabelleğe Eczacılık ekleyerek veya atriyal gangliyon hedeflenen modülasyon tarafından yerel olarak gerçekleştirilir. Tüm kan hücreleri boyama kalitesini artırabilir sürekli perfüzyon nedeniyle kaldırıldı olarak deneyler sonra kalpleri bir immunohistological değerlendirme için de uygundur.
Açıklanan teknikleri genel amacı kardiyak Elektrofizyoloji ve fare kalbinde arrhythmogenesis otonom sinir sisteminin etkisi konusunda ayrıntılı çalışmalar için yeni perspektifler sunmaktır. Bu tekniği kullanmak için bir neden çalışma ve otonom sinir sistemi merkezi sinir sistemine etkisi olmadan değiştirmek mümkün olmasıdır. Bir büyük avantajı kolay istihdam farmakolojik deneylerinde potansiyel pro – ya da antiarrhythmic özellikleri eski ve yeni acentalar test. Buna ek olarak, transgenik ve nakavt fare modelleri çeşitli kardiyak hastalıkların aritmiler, kalp yetmezliği veya metabolik hastalıkların altında yatan mekanizmaları incelemek kullanılabilir. Bu yaklaşımı otonom sinir sistemi atriyal düzeyde ventrikül kardiyak Elektrofizyoloji ve aritmiler indüksiyon nasıl etkileyebilir bizim anlayış geliştirmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, iyi bilinen Langendorff ex vivo kalp perfüzyon sistemi etkisi kardiyak Elektrofizyoloji ve arrhythmogenesis intrakardiyak nöronların farklı eşleme ve stimülasyon teknikleri kullanarak çalışma için bir araç olarak sunulan endocardial ve epicardial yaklaşımlar da dahil olmak üzere.
İletişim kuralı’nın çeşitli yerlerinde kurulum için büyük önem taşımaktadır. İlk olarak, atriyal yağ yastıkları bozulmamış kalmak veya hızlı bir şekilde Miyokard…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar için onun mükemmel teknik yardım ve UKE mikroskobu görüntüleme Merkezi (Umif), Üniversitesi Tıp Merkezi Hamburg-mikroskoplar ve destek sağlamak için Eppendorf Hartwig Wieboldt teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma tarafından finanse edilen yanında Dernegimizin des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. yapıldı ve DZHK (Almanca Kardiyovasküler Araştırma Merkezi) tarafından [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET | |
References
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Hearse, D. J., Sutherland, F. J. Experimental models for the study of cardiovascular function and disease. Pharmacological Research. 41 (6), 597-603 (2000).
- Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49 (3), 171-181 (2004).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff-still viable in the new millennium. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Langendorff, O. Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Archiv. 61, 291-332 (1895).
- Matsumoto-Ida, M., Akao, M., Takeda, T., Kato, M., Kita, T. Real-time 2-photon imaging of mitochondrial function in perfused rat hearts subjected to ischemia/reperfusion. Circulation. 114 (14), 1497-1503 (2006).
- Rassaf, T., Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., Shiva, S., Heusch, G., Kelm, M. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circulation Research. 114 (10), 1601-1610 (2014).
- Schechter, M. A., et al. An isolated working heart system for large animal models. Journal of Visualized Experiments. 88 (88), 51671 (2014).
- Stockigt, F., et al. Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart. PLoS One. 7 (11), e49203 (2012).
- Berul, C. I. Electrophysiological phenotyping in genetically engineered mice. Physiological Genomics. 13 (3), 207-216 (2003).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacology & Therapeutics. 139 (2), 213-248 (2013).
- Schrickel, J. W., et al. Enhanced heterogeneity of myocardial conduction and severe cardiac electrical instability in annexin A7-deficient mice. Cardiovascular Research. 76 (2), 257-268 (2007).
- Rudolph, V., et al. Myeloperoxidase acts as a profibrotic mediator of atrial fibrillation. Nature Medicine. 16 (4), 470-474 (2010).
- Jungen, C., et al. Disruption of cardiac cholinergic neurons enhances susceptibility to ventricular arrhythmias. Nature Communications. 8, 14155 (2017).
- Calebiro, D., et al. Persistent cAMP-signals triggered by internalized G-protein-coupled receptors. PLoS Biology. 7 (8), e1000172 (2009).
- Sprenger, J. U., Perera, R. K., Götz, K. R., Nikolaev, V. O. FRET microscopy for real-time monitoring of signaling events in live cells using unimolecular biosensors. Journal of Visualized Experiments. (66), e4081 (2012).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nature Methods. 4 (1), 31-33 (2007).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2.28.1-2.28.12 (2017).
- Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
- Wengrowski, A. M., Wang, X., Tapa, S., Posnack, N. G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function. Cardiovascular Research. 105 (2), 143-150 (2015).
- Rivinius, R., et al. Control of cardiac chronotropic function in patients after heart transplantation: effects of ivabradine and metoprolol succinate on resting heart rate in the denervated heart. Clinical Research in Cardiology. , (2017).
- Ajijola, O. A., et al. Augmentation of cardiac sympathetic tone by percutaneous low-level stellate ganglion stimulation in humans: a feasibility study. Physiological Reports. 3 (3), e12328 (2015).
