Impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de Langendorff Ex Vivo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e acampamento dinâmica usando uma configuração de Langendorff ex vivo .
Abstract
Desde a sua invenção noséculo 19 tarde , o sistema de perfusão do Langendorff ex vivo coração continua a ser uma ferramenta relevante para o estudo de um amplo espectro de parâmetros fisiológicos, bioquímicos, morfológicos e farmacológicos em corações centralmente desnervadas. Aqui, descrevemos uma configuração para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e dinâmica de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP). O sistema nervoso autônomo intracardíaco é modulado pela dissecção mecânica da gordura atrial almofadas-no quais murino gânglios estão localizados principalmente — ou pelo uso de intervenções farmacológicas globais, bem como alvo. Um cateter eletrofisiológicos octapolar é introduzido no átrio direito e o ventrículo direito, e multi eletrodos epicárdico colocado matrizes (MEA) para mapeamento de alta resolução são usados para determinar arritmogênica e Eletrofisiologia cardíaca. Transferência de energia de ressonância Förster (FRET) imagem é realizada para o monitoramento em tempo real dos níveis de campo em diferentes regiões cardíacas. Neuromorphology é estudado por meio de anticorpos-baseado coloração de todo o coração usando marcadores neuronais para orientar a identificação e a modulação de metas específicas do sistema nervoso autonomic intracardíaco nos estudos realizados. A configuração de Langendorff ex vivo permite um elevado número de experimentos reprodutíveis em um curto espaço de tempo. No entanto, a natureza parcialmente aberta da instalação (ex., durante as medições de MEA) dificulta o controle de temperatura constante e deve ser mantida a um mínimo. Esse método descrito torna possível analisar e modulam o sistema nervoso autônomo intracardíaco em corações descentralizadas.
Introduction
O sistema de perfusão do Langendorff ex vivo coração continua a ser uma ferramenta relevante para a realização de um amplo espectro de fisiológicas, bioquímicas, morfológicas e estudos farmacológicos em centralmente desnervados corações1,2 ,3,4,5 , desde a sua invenção no final 19th do século6. Até à data, este sistema é ainda amplamente utilizado para vários tópicos (EG., reperfusão de isquemia) ou estudar cardíaco farmacológico efeitos7,8e é uma ferramenta básica em pesquisa cardiovascular. A longevidade deste método resulta de várias vantagens (ex., as medições são realizadas sem a influência do sistema nervoso central ou outros órgãos, circulação sistêmica ou hormônios circulantes). Se necessário, produtos farmacêuticos podem ser adicionados de forma controlada para o buffer de perfusão ou aplicados diretamente às estruturas específicas. Experimentos são reprodutíveis, e um número relativamente elevado de experiências pode ser executado em um curto período de tempo. A natureza aberta (em parte) da instalação do pode tornar difícil de regulação da temperatura e precisa ser levado em conta. Embora o sistema de Langendorff também é usado em maior espécie9, animais menores são usados principalmente como a instalação experimental é menos complexo e uma maior variabilidade biológica (EG., transgénicos mouse modelos) podem ser usados.
No menu configuração experimental do presente protocolo, a influência do sistema nervoso autonomic intracardíaca de parâmetros eletrofisiológicos básicos, arritmogênica ventricular, condução Epicárdica e dinâmica de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) é avaliada. Um grande número de gânglios intracardíacos, que localizam-se principalmente nas almofadas de gordura atrial e agora são conhecidos para controlar Eletrofisiologia Cardíaca independente de controle neural central, é que também deixou intacta ou removido manualmente com cuidado mecânica dissecação. Uma modulação farmacológica do sistema nervoso autonomic é realizada globalmente pela adição de produtos farmacêuticos para o buffer de perfusão ou localmente pela modulação alvo de gânglios atrial. Após os experimentos, os corações são adequados para uma avaliação reagidos como todas as células do sangue foram removidas devido a perfusão contínua, que pode aumentar a qualidade da coloração.
O objetivo geral das técnicas descritas é oferecer novas perspectivas para estudos detalhados sobre o impacto a nível do sistema nervoso autônomo na eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica no coração do mouse. Uma razão para usar essa técnica é que é possível estudar e alterar o sistema nervoso autônomo sem o impacto do sistema nervoso central. Uma grande vantagem é o fácil emprego de experimentos farmacológicos, em quais pro – ou antiarrítmicas Propriedades potenciais de velhos e novos agentes podem ser testados. Além disso, modelos de rato transgénico e nocaute de várias doenças cardíacas estão disponíveis para investigar os mecanismos subjacentes a arritmias, insuficiência cardíaca ou doenças metabólicas. Esta abordagem tem reforçado a nossa compreensão de como o sistema nervoso autônomo no nível atrial podem afetar Eletrofisiologia Cardíaca ventricular e a indução de arritmias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste manuscrito, o conhecido Langendorff ex vivo coração perfusão sistema é apresentado como uma ferramenta para estudar o impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica usando mapeamento diferente e técnicas de estimulação incluindo as abordagens endocárdico e Epicárdica.
Várias partes do protocolo são cruciais para a instalação. Em primeiro lugar, é importante o uso de uma técnica de preparação em que as almofadas de gordura atri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria agradecer Hartwig Wieboldt por sua excelente assistência técnica e o UKE microscopia Imaging Facility (Umif) da universidade médica centro de Hamburgo-Eppendorf para fornecer suporte e microscópios. Esta pesquisa foi financiada bythe Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. e pelo DZHK (centro alemão de pesquisa Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].
Materials
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium hydrogencarbonate | Sigma-Aldrich | 401676 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Sodium pyruvate bioXtra | Sigma-Aldrich | P8574 | Modified Krebs-Henleit solution |
| Carbogen (95% O2 / 5% CO2) | SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Germany | Modified Krebs-Henleit solution | |
| Sterile filter steritop-GP 0.22 | EMD Millipore | SCGPT05RE | Modified Krebs-Henleit solution |
| Atropine sulfate | Sigma-Aldrich | A0257 | Neuromodulation |
| Hexamethonium chloride | Sigma-Aldrich | H2138 | Neuromodulation |
| Nicotine free base 98-100% | Sigma-Aldrich | N3876 | Neuromodulation |
| Formalin solution neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | Whole mount staining |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 | Whole mount staining |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Whole mount staining |
| Hydrogen peroxide solution 30% (w/w) in H2O | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | H1009 | Whole mount staining |
| Dimethyl sulfoxide | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | D8418 | Whole mount staining |
| Phosphate-buffered saline tablets | Gibco / Invitrogen | 18912-014 | Whole mount staining |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Whole mount staining |
| Albumin bovine fraction V | Biomol, Hamburg, Germany | 11924.03 | Whole mount staining |
| Chicken anti neurofilament | EMD Millipore | AB5539 | Whole mount staining |
| Rabbit anti tyrosine hydroxylase | EMD Millipore | AB152 | Whole mount staining |
| Goat anti choline acetyltransferase | EMD Millipore | AP144P | Whole mount staining |
| Donkey α rabbit IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Whole mount staining |
| Donkey α goat IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Whole mount staining |
| Donkey α chicken IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Germany | AP194SA6 | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α rabbit igG | R&D Systems | AP182B | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated donkey α goat igG | R&D Systems | AP192P | Whole mount staining |
| Biotin-conjugated goat α chicken igY | R&D Systems | BAD010 | Whole mount staining |
| Vectashield mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | H-1000 | Immunohistochemistry |
| Vectastain ABC kit | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | PK-4000 | Immunohistochemistry |
| Steady DAB/Plus | Abcam plc, Cambridge, UK | ab103723 | Whole mount staining |
| HistoClear | DiaTec, Bamberg, Germany | HS2002 | Immunohistochemistry |
| BisBenzimide H33342 trihydrochloride (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B2261 | Immunohistochemistry |
| Vectashield HardSet mounting medium | Vector laboratories, Burlingame, CA, USA | VEC-H-1400 | Immunohistochemistry |
| Perfusion system | HUGO SACHS ELEKTRONIK – HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Germany | 73-4343 | Langendorff apparatus |
| Data acquisition system and corresponding software for catheter and physiological parameter | Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, New Zealand | PL3508 PowerLab 8/35 | Langendorff setup |
| Octapolar catheter | CIB’ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA | custom | Langendorff setup |
| Stimulus generator | STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | STG4002-160µA | Stimulation setup |
| Stimulation software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Stimulus II | Stimulation setup |
| Data acquisition system and corresponding software for epicardial electrograms | ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | USB-ME128-System | MEA setup |
| Multi-electrode array | MEA, EcoFlexMEA36, Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | EcoFlexMEA36 | MEA setup |
| Multi-electrode array recording software | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | MC_Rack | MEA setup |
| Spring scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 15003-08 | Heart Preparation |
| Strabismus Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14575-09 | Heart Preparation |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 14110-15 | Heart Preparation |
| Dumont SS Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11203-25 | Heart Preparation |
| London Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11080-02 | Heart Preparation |
| Narrow Pattern Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germany | 11003-13 | Heart Preparation |
| Plastic Wrap | Parafilm M, Bemis NA, based in Neenah, WI, United States | Consumable Materials | |
| Stereomicroscope | Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany | FRET | |
| LED | CoolLED, Andover, UK | pE-100 | FRET |
| DualView | Photometrics, Tucson, AZ, USA | DV2-SYS | FRET |
| DualView filter set | Photometrics, Tucson, AZ, USA | 05-EM | FRET |
| optiMOS scientific CMOS camera | Qimaging, Surrey, BC, Canada | 01-OPTIMOS-R-M-16-C | FRET |
| Imaging software | Micro-Manager; Vale Lab, University of California San Francisco, CA, USA | FRET | |
| Analysis Software | Image J software; Public Domain, NIH, USA | FRET | |
References
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