3-الأبعاد (3D)--طباعة قالب للجنين الزرد الإنتاجية العالية أرايينج
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتصميم واختلاق جنينا الزرد أرايينج القالب، يليه إجراء مفصل عن استخدام هذا القالب للإنتاجية العالية الزرد الجنين أرايينج في لوحة 96-جيدا.
Abstract
الزرد كائن معترف به عالمياً من مياه العذبة استخداماً في علم الأحياء التنموي، وعلم السموم البيئية والأمراض البشرية المجالات البحثية ذات الصلة. بفضل ميزات فريدة من نوعها، بما في ذلك خصوبة كبيرة، الشفافية الجنين، والتنمية السريعة والفورية، إلخ، الزرد الأجنة غالباً ما تستخدم لتقييم السمية واسعة النطاق للمواد الكيميائية والمخدرات/مجمع الفرز. إجراء فحص نموذجي ينطوي على التفريخ الزرد الكبار، واختيار الأجنة، وأرايينج الأجنة في لوحات متعددة جيدا. من هناك، تتعرض الأجنة للتعرض ومدى سمية المادة الكيميائية، أو يمكن تقييم فعالية العقاقير/المركبات بسرعة نسبيا استناداً إلى الملاحظات المظهرية. ومن بين هذه العمليات، الأجنة أرايينج هو إحدى الخطوات الأكثر استهلاكاً للوقت وكثيفة العمالة التي تحد من مستوى الإنتاجية. في هذا البروتوكول، نقدم نهجاً مبتكراً أن يجعل استخدام قالب أرايينج طباعة 3D مقترنة بفراغ التلاعب الإسراع بهذه الخطوة شاقة. ويصف البروتوكول هنا التصميم العام للقالب أرايينج، الإعداد التجريبية التفصيلية والإجراءات خطوة بخطوة، تليها النتائج الممثل. عند تنفيذها، ينبغي أن يثبت هذا النهج مفيداً في مجموعة متنوعة من التطبيقات البحثية باستخدام أجنة الزرد كاختبار المواضيع.
Introduction
ككائن نموذج الشعبي، الزرد يستخدم على نطاق واسع في مجالات الطب وعلم السموم1،2،،من34. مقارنة بمنصات في المختبر ، الزرد توفر الكثير من التعقيدات البيولوجي أكبر أن أحد أو لا يمكن أن تقدم نوعين من الخلايا. إضافة إلى كونه كائناً كامل النموذجي وخصوبتها كبيرة الزرد والسريع والمتزامن من التنمية الجنينية والجهاز عالية أعطت الشفافية هذا النموذج مزايا فريدة من نوعها لاستخدامها لسمية واسعة النطاق أو المخدرات/مجمع الفرز5. مئات الأجنة التي تنتجها زوج واحد من الزرد الكبار كل أسبوع تفوق أي نماذج حيوانية أسرة أخرى وجعلت مناسبة لفحص إنتاجية عالية.
إجراء فحص نموذجي باستخدام الزرد ينطوي على قدر كبير من العمل اليدوي، مثل الكبار الزرد التفريخ، اختيار الأجنة، وأرايينج الأجنة في حاويات مناسبة حيث أنهم يتعرضون للتعرض عن طريق غمر المياه. ويرصد وضع الأجنة ونهايات يمكن ملاحظتها مثل معدلات الوفيات، وإمكانية فقس البيض، والشذوذ غالباً ما قيمت يدوياً ويستخدم كتعريفات أولية لسمية المواد الكيميائية أو مؤشرات لمدى فعالية العقاقير أو المركبات. لتسريع إجراءات الفرز، تم استكشاف النهج مثل التصوير الآلي وتحليل الصور الحاسوب مسبقاً. على سبيل المثال، مجاهر مع المحتوى العالي من قدرات التصوير وقد تم تكييف أداء الآلي مشرق الحقل أو تصوير الأسفار على الأجنة الزرد في مختلف مراحل النمو من لوحات جيدا 96/3846. أجهزة موائع جزيئية مقترنة بالمجاهر استخدمت لوضع اليرقات الزرد من خلال التلاعب الحالي لتصوير الدماغ الخلايا العصبية7. هذه النهج يمكن تحسين كبير في كفاءة عمليات اقتناء الصورة مقارنة بالتشغيل اليدوي التقليدي. وعلاوة على ذلك، مع عدد كبير من الصور التي يتم إنشاؤها، أدوات تحليل الصورة كما وضعت لتسريع عملية معالجة البيانات، كما يتبين من ليو وآخرون وتو et al. 8 , 9.
كما يزيد مستوى الإنتاجية لتحليل التصوير والصورة، أصبح من الواضح أن هذه الخطوة الحد من معدل للفحص يكمن في عملية إعداد أجنة الزرد للتعرض، والذي يعني عادة أرايينج منهم إلى 96-384 جيدا أو لوحات. لحل هذه الخطوة عنق الزجاجة، وضعت موجهة برؤية الروبوتات ماندريل et al. 10 ولنا11 سابقا ليحل محل المناولة اليدوية ولكن الأدوات متطورة بل وهناك منحنى التعلم عميق لتنفيذ مثل هذه التقنيات. ولذلك، لتوفير نهج سهلة الاستخدام يصبح أحد العوامل الهامة لزيادة تحسين مستوى الإنتاجية لفحص الزرد، وهو الهدف الرئيسي لهذا العمل.
في هذا العمل، ونحن تصميم وملفقة جنين أرايينج قالب عليها 3D الطباعة. صمم قالب أرايينج لإيقاع الجنين الزرد إلى الآبار التي تناسب مع صفيحة 96-جيدا قياسية. بدلاً من اختيار الأجنة وأرايينج لهم في بئر فرادى واحداً تلو الآخر، أحد يمكن تنفيذ فخ الجنين ومجموعة جميع أجنة 96 في صفيحة الجدر مرة واحدة. باستخدام هذا القالب والبروتوكول التالي، واحد يمكن زيادة كبيرة في الكفاءة من أرايينج الأجنة في لوحات الجدر، والتي ستكون في الأجل زيادة قدرة الفرز على الأقل عشرة إضعاف، مقارنة بالتشغيل اليدوي. ويشمل البروتوكول هو موضح أدناه تصميم العام أرايينج القالب، تفريخ الزرد، جمع الجنين، وأرايينج. ويبين الشكل 1 التصميم العام للقالب أرايينج. ويبين الشكل 2 لمحة عامة عن البروتوكول خطوة بخطوة حول استخدام قالب الموصوفة في الأجزاء 3 و 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك اثنين من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تتطلب اهتماما وثيقا لتنفيذ ناجح لقالب طباعة 3D أرايينج الأجنة الزرد.
هو العامل الأكثر أهمية في تصميم القالب أرايينج الفخ أيضا. يجعل بالتأكيد هناك جنين واحد فقط محاصرين في كل بئر، واحدة ينبغي إيلاء اهتمام وثيق للقطر وعمق ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها البرنامج “1000plan الشباب” و “أموال بدء التشغيل” من جامعة تونغجى، وتشرف منحة # 21607115 21777116 (لين).
Materials
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 – 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
