Een 3-dimensionale (3D)-sjabloon voor High Throughput Zebrafish Embryo Arraying afgedrukt
Summary
Hier presenteren we een protocol te ontwerpen en fabriceren van een embryo van de zebravis arraying sjabloon, gevolgd door een gedetailleerde procedure op het gebruik van deze sjabloon voor hoge doorvoer zebrafish embryo arraying in een 96-wells-plaat.
Abstract
De zebravis is dat een wereldwijd erkende zoetwater organisme vaak gebruikt in Ontwikkelingsbiologie, milieutoxicologie en ziekten bij de mens verwante onderzoeksterreinen. Dankzij haar unieke eigenschappen, met inbegrip van grote vruchtbaarheid embryo doorschijnendheid, snelle en gelijktijdige ontwikkeling, enz., zebravis embryo’s worden vaak gebruikt voor grootschalige toxiciteit beoordeling van chemische stoffen en drug/compound screening. Een typische screeningprocedure omvat volwassen zebrafish kuitschieten, selectie van embryo’s en de embryo’s in multi goed platen arraying. Vanaf daar embryo’s worden onderworpen aan blootstelling en de giftigheid van chemische of de doeltreffendheid van de drugs/verbindingen kan relatief snel op basis van fenotypische opmerkingen worden geëvalueerd. Onder deze processen is embryo’s arraying een van de meest tijdrovend en arbeidsintensief stappen waarmee de doorvoer niveau wordt beperkt. In dit protocol presenteren wij een innovatieve benadering die maakt gebruik van een 3D-gedrukte arraying sjabloon in combinatie met vacuüm manipulatie om te versnellen deze moeizame stap. Het protocol hierin beschrijft de algemene opzet van de arraying sjabloon en een stapsgewijze procedure, gevolgd door representatieve resultaten en gedetailleerde experimentele opzet. Bij de uitvoering van moet deze aanpak voordelig blijken te zijn in een verscheidenheid van toepassingen van onderzoek gebruik van zebravis embryo’s als het testen van onderwerpen.
Introduction
Als een populaire modelorganisme, wordt zebravis veel gebruikt op het gebied van geneeskunde en toxicologie1,2,3,4. Vergeleken bij in vitro platformen, zebravis bieden veel meer biologische complexiteit dat een of twee celtypes kunnen niet bieden. Naast een hele organisme model, van de zebravis grote vruchtbaarheid, snelle en gelijktijdige embryonale ontwikkeling en hoge orgel translucentie hebben gegeven de unieke voordelen van dit model worden gebruikt voor grootschalige toxiciteit of drugs/samengestelde screening van5. De honderden embryo’s geproduceerd door een paar volwassen zebrafish elke week overtreffen elke andere hele diermodellen en het geschikt voor hoge throughput screening hebben gemaakt.
Een typische screeningprocedure met behulp van de zebravis impliceert een aanzienlijke hoeveelheid handenarbeid, zoals volwassen zebrafish kuitschieten, embryo selectie, en arraying embryo’s in geschikte containers waar zij zijn onderworpen aan een blootstelling via water onderdompeling. De ontwikkeling van de embryo’s wordt gecontroleerd en waarneembare eindpunten zoals sterfte en uitkomstpercentage abnormaliteit zijn vaak handmatig geëvalueerd en gebruikt als de voorlopige identificaties van de giftigheid van chemische stoffen of aanwijzingen voor de effectiviteit van drugs of verbindingen. Om te versnellen naar de screeningprocedure, werden benaderingen zoals geautomatiseerde beeldvorming en beeldanalyse computerondersteunde eerder onderzocht. Bijvoorbeeld, zijn microscopen met een hoog gehalte imaging mogelijkheden aangepast om te voeren geautomatiseerde helder-veld of fluorescentie imaging op zebrafish embryo’s op verschillende ontwikkelingsstadia van 96/384 goed platen6. Microfluidic apparaten in combinatie met microscopen werden gebruikt om de positie van de zebravis larven door manipulatie van de huidige voor beeldvorming van de hersenen neuronen7. Deze benaderingen kon aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van de overnames van de afbeelding ten opzichte van traditionele handmatige bediening. Bovendien, met een groot aantal afbeeldingen wordt gegenereerd, beeld analyse gereedschappen zijn ook ontwikkeld om te versnellen naar de verwerking van de gegevens, zoals aangetoond door Liu et al. en Tu et al. 8 , 9.
Als het niveau van de doorvoer van beeldvorming en foto analyse toeneemt, werd het duidelijk dat de snelheidslimieten stap voor screening ligt bij de voorbereiding van de zebravis embryo’s voor blootstelling, wat meestal betekent arraying hen in 96 – of 384-Wells-platen. Om op te lossen dit knelpunt stap, visie-geleide robotica werden ontwikkeld door Mandrell et al. 10 en ons11 eerder te vervangen manueel hanteren, maar de instrumenten waren nogal verfijnde en er is een diepe leercurve om dergelijke technieken. Daarom, om te zorgen voor een easy-to-use aanpak wordt een belangrijke factor om het niveau van de doorvoer van zebravis screening verder te verbeteren en is de belangrijkste doelstelling van dit werk.
In dit werk, we ontworpen en gefabriceerd van een embryo arraying sjabloon door 3D printen. Dergelijke een arraying sjabloon is ontworpen om het vangen van zebravis embryo in putten die bij een standaard 96-wells-plaat passen. In plaats van de selectie van embryo’s en arraying hen in individuele put één voor één, kon één embryo entrapment en matrix alle 96 embryo’s in een multiwall plaat tegelijk uitvoeren. Met behulp van deze sjabloon en het volgende protocol, kan een aanzienlijk verhoging van de efficiëntie van het arraying embryo’s in multiwall platen, die zou in termijn boost de screening capaciteit ten minste vertienvoudigd, ten opzichte van handmatige bediening. De hieronder beschreven protocol bevat een totaalconcept voor de arraying sjabloon, zebravis kuitschieten, embryo’s worden verzameld en arraying. Figuur 1 toont de algemene opzet van de arraying sjabloon. Figuur 2 geeft een overzicht van de stapsgewijze protocol over het gebruik van de sjabloon in delen 3 en 4 beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn twee essentiële stappen in dit protocol die nauwlettend in de gaten voor een succesvolle implementatie van 3D-gedrukte sjabloon voor arraying zebrafish embryo’s vereisen.
De meest belangrijke factor op het ontwerp van de arraying sjabloon is de entrapment goed. Maakt zeker er is slechts één embryo gevangen in elk putje, een moet aandacht besteden aan de diameter en de diepte van de put entrapment, en de diameter van het door gat. De aanbevolen diameter is binnen 1,5 tot 2 keer van d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het “1000plan Youth”-programma, het opstarten middelen uit Tongji Universiteit en NSFC Grant # 21607115 en 21777116 (Lin).
Materials
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 – 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
