Un 3-dimensionale (3D)-stampato modello per High Throughput embrione di pesce zebra Arraying
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per progettare e fabbricare un embrione di zebrafish arraying modello, seguita da una procedura dettagliata sull’uso di tale modello per throughput elevato zebrafish embrione arraying in una piastra a 96 pozzetti.
Abstract
Zebrafish è che un organismo riconosciuto a livello mondiale di acqua dolce frequentemente utilizzato in biologia dello sviluppo, tossicologia ambientale e malattia umana campi di ricerca correlate. Grazie alle sue caratteristiche uniche, tra cui la grande fecondità, traslucidità dell’embrione, sviluppo rapido e simultaneo, ecc., embrioni di zebrafish sono spesso utilizzati per la valutazione della tossicità su larga scala di prodotti chimici e droghe/mescola lo screening. Una procedura di screening tipica prevede la deposizione delle uova di zebrafish adulto, selezione di embrioni e arraying gli embrioni in piastre multi-pozzetto. Da lì, gli embrioni sono sottoposti per l’esposizione e la tossicità del prodotto chimico, o l’efficacia dei farmaci/composti può essere valutato relativamente rapidamente basata su osservazioni fenotipiche. Tra questi processi, embrioni arraying sono uno dei passaggi più molto tempo e laboriosi che limita il livello di velocità effettiva. In questo protocollo, vi presentiamo un approccio innovativo che fa uso di un modello di arraying 3D-stampato accoppiato con manipolazione per accelerare questa laboriosa fase di vuoto. Il protocollo di questo documento descrive il disegno complessivo del modello arraying, una dettagliata messa a punto sperimentale e della procedura, seguita da risultati rappresentativi. Quando implementato, questo approccio dovrebbe rivelarsi vantaggioso in una varietà di applicazioni di ricerca utilizzando embrioni di zebrafish come soggetti di prova.
Introduction
Come organismo modello popolare, zebrafish è ampiamente usato nei campi della medicina e tossicologia1,2,3,4. Rispetto alle piattaforme in vitro , zebrafish offrono molto maggiore complessità biologica che uno o due tipi di cellule non potevano offrire. Oltre ad essere un intero organismo modello, grande fecondità di zebrafish, rapido e simultaneo dello sviluppo embrionale e organo ad alta traslucenza hanno dato questo vantaggi unici di modello da utilizzarsi per tossicità su larga scala o farmaci/mescola5di screening. Le centinaia di embrioni prodotti da una coppia di zebrafish adulto ogni settimana superano tutti gli altri modelli animali intero e hanno reso adatto per screening su vasta scala.
Una procedura di screening tipica utilizzando zebrafish comporta una notevole quantità di lavoro manuale, ad esempio di zebrafish adulto deposizione delle uova, selezione degli embrioni e arraying embrioni in idonei contenitori dove sono sottoposti all’esposizione attraverso l’immersione in acqua. Lo sviluppo degli embrioni è monitorato e osservabile endpoint come anomalia, la schiusa e la mortalità sono spesso valutati manualmente e utilizzati come le identificazioni preliminari la tossicità di sostanze chimiche o indicazioni sull’efficacia del farmaci o composti. Per velocizzare la procedura di screening, approcci come l’imaging automatici e analisi di immagine computerizzata sono stati esplorati precedentemente. Ad esempio, microscopi ad alto contenuto funzionalità di imaging sono stati adattati per eseguire automatizzato del luminoso-campo o fluorescenza sugli embrioni di zebrafish alle varie fasi di sviluppo da 96/384 pozzetti6. Dispositivi microfluidici accoppiati con microscopi sono stati utilizzati per posizionare le larve di zebrafish tramite manipolazione corrente per l’imaging del cervello neuroni7. Questi approcci potrebbero migliorare sensibilmente l’efficienza delle acquisizioni di immagine rispetto al tradizionale funzionamento manuale. Inoltre, con gran numero di immagini viene generato, strumenti di analisi di immagine sono anche stati sviluppati per velocizzare l’elaborazione di dati, come dimostrato da Liu et al e Tu et al. 8 , 9.
Come aumenta il livello di velocità effettiva di analisi di formazione immagine e l’immagine, è diventato chiaro che il passaggio limitante per lo screening si trova nel processo di preparazione di embrioni di zebrafish per l’esposizione, che in genere significa arraying li in piastre da 96 o 384 pozzetti. Per risolvere questo passaggio di collo di bottiglia, Fixed-based robotics sono stati sviluppati da Mandrell et al. 10 e noi11 in precedenza per sostituire movimentazione manuale ma gli strumenti erano piuttosto sofisticato e c’è una curva di apprendimento profonda per implementare tali tecniche. Di conseguenza, per fornire un approccio easy-to-use diventa un fattore importante per migliorare ulteriormente il livello di velocità effettiva dello zebrafish screening ed è l’obiettivo principale di questo lavoro.
In questo lavoro, abbiamo progettato e fabbricato un embrione arraying modello di stampa 3D. Un modello di questo arraying è stato progettato per intrappolare embrione di pesce zebra in pozzetti che si adattano con una piastra a 96 pozzetti standard. Anziché selezionare embrioni e li arraying in singoli pozzetti uno per uno, uno potrebbe eseguire matrice e l’allettamento di embrione 96 tutti gli embrioni in una piastra a parete multipla in una sola volta. Utilizzando questo modello e il seguente protocollo, uno potrebbe aumentare significativamente l’efficienza di arraying embrioni in lastre multiparete, che a termine Spinta la capacità di screening almeno dieci volte, rispetto al funzionamento manuale. Il protocollo descritto di seguito include un disegno complessivo per la disposizione di modello, la deposizione delle uova di pesce zebra, raccolta degli embrioni e arraying. La figura 1 Mostra il disegno complessivo del modello arraying. La figura 2 Mostra una panoramica del protocollo dettagliata sull’utilizzo del modello descritto nelle parti 3 e 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono due punti critici in questo protocollo che richiedono particolare attenzione per la corretta implementazione del modello di stampa 3D per arraying embrioni di zebrafish.
Il fattore più importante sul design del modello arraying è l’allettamento. Rende sicuro che c’è un solo embrione intrappolato in ciascun pozzetto, uno dovrebbe prestare particolare attenzione per il diametro e la profondità del pozzo allettamento e il diametro del foro passante. Il diametro consigliato è all’inte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal programma “gioventù 1000plan”, i fondi di avvio da Università di Tongji e NSFC Grant # 21607115 e 21777116 (Lin).
Materials
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 – 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
