3 dimensiones (3D)-impreso la plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra matriz
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para diseñar y fabricar un embrión de pez cebra colocar plantilla, seguido de un procedimiento detallado sobre el uso de dicha plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra colocar en una placa de 96 pocillos.
Abstract
El pez cebra es que un organismo reconocido a nivel mundial de agua dulce utilizadas en Biología del desarrollo, toxicología ambiental y enfermedades humanas campos de investigación relacionados. Gracias a sus características únicas, incluyendo gran fecundidad, translucidez del embrión, desarrollo rápido y simultáneo, etc., embriones de pez cebra se suelen utilizar para la evaluación de la toxicidad de gran escala de sustancias químicas y drogas/compuesto proyección. Un procedimiento típico de proyección implica el desove del pez cebra adulto, la selección de embriones y colocar los embriones en placas de varios pocillos. A partir de ahí, los embriones son sometidos a la exposición y la toxicidad del producto químico, o puede evaluar la eficacia de los compuestos de drogas relativamente rápidamente en base a observaciones fenotípicas. Entre estos procesos, colocar los embriones es uno de los pasos más desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva que limita el nivel de rendimiento. En este protocolo, presentamos un enfoque innovador que hace uso de una plantilla de arraying impreso en 3D junto con vacío manipulación para acelerar este paso laborioso. El protocolo en el presente documento describe el diseño general de la plantilla arraying, una configuración experimental detallada y paso a paso, procedimiento por resultados representativos. Cuando se implementa, este enfoque resulta beneficioso en una variedad de aplicaciones de la investigación con embriones de pez cebra como sujetos de prueba.
Introduction
Como un organismo modelo popular, el pez cebra es ampliamente utilizado en los campos de la medicina y toxicología1,2,3,4. Comparado con plataformas en vitro , pez cebra ofrecen mucho mayor complejidad biológica que uno o dos tipos de la célula no podrían ofrecer. Además de ser un organismo modelo de pez cebra gran fecundidad, desarrollo embrionario rápido y simultáneo y órgano alta translucidez han dado este ventajas únicas del modelo a utilizar para toxicidad de gran escala o detección de5drogas/compuesto. Los cientos de embriones producidos por un par de pez cebra adulto cada semana superan otros modelos todo animales y han hecho conveniente para el cribado de alto rendimiento.
Un procedimiento típico de proyección utilizando el pez cebra implica una cantidad significativa de trabajo manual, como el pez cebra adulto desove, selección de embriones y colocar los embriones en recipientes adecuados donde son sometidos a la exposición a través de la inmersión en agua. Se monitorea el desarrollo de los embriones y extremos observables como anormalidad, incubabilidad y mortalidad a menudo son evaluados manualmente y utilizados como la identificación preliminar de la toxicidad de productos químicos o las indicaciones de la efectividad de drogas o compuestos. Para acelerar el procedimiento de investigación, enfoques como la proyección de imagen automatizada y análisis de imagen asistida por computador han sido explorados previamente. Por ejemplo, microscopios con alto contenido de capacidades de la proyección de imagen han sido adaptados para realizar automatizado campo brillante o proyección de imagen de fluorescencia en embriones de pez cebra en las distintas etapas del desarrollo de placas de 96/384 pozos6. Dispositivos microfluídicos juntados con microscopios fueron utilizados para colocar las larvas de pez cebra a través de la manipulación actual de proyección de imagen de cerebro neuronas7. Estos enfoques podrían mejorar significativamente la eficiencia de adquisición de imagen en comparación con la tradicional operación manual. Por otra parte, con gran cantidad de imágenes generadas, herramientas de análisis de imagen también se han desarrollado para acelerar el procesamiento de datos, según lo demostrado por Liu et al. y Tu et al. 8 , 9.
A medida que aumenta el nivel de rendimiento de análisis de imagen y proyección de imagen, se hizo evidente que el paso de limitación de velocidad para la investigación se encuentra en el proceso de preparación de embriones de pez cebra para la exposición, que por lo general significa colocar en placas de 96 o 384 pocillos. Para resolver este paso cuello de botella, guiada por la visión robótica fueron desarrollados por Mandrell et al. 10 y nos11 anteriormente para reemplazar la manipulación manual pero los instrumentos eran bastante sofisticados y hay una profunda curva de aprendizaje para implementar dichas técnicas. Por lo tanto, para proporcionar un enfoque de fácil uso se convierte en un factor importante para mejorar el nivel de rendimiento de la detección de pez cebra y es el principal objetivo de este trabajo.
En este trabajo, hemos diseñado y había fabricado un embrión colocar plantilla de impresión 3D. Una plantilla así de arraying fue diseñada para atrapar el embrión de pez cebra en pozos que se ajustan a una estándar placa de 96 pocillos. En lugar de embriones para seleccionar y colocar en cada pozo uno por uno, uno podría realizar matriz y atrapamiento de embrión 96 todos los embriones en una placa multicapa a la vez. Utilizando esta plantilla y el protocolo siguiente, uno podría aumentar significativamente la eficacia de colocar los embriones en placas multicapa, que en término de impulso por lo menos diez veces, la capacidad de detección en comparación con operación manual. El protocolo que se describe a continuación incluye un diseño global para colocar la plantilla, el desove del pez cebra, colección embrionaria y matriz. La figura 1 muestra el diseño general de la plantilla arraying. La figura 2 muestra un resumen del protocolo paso a paso sobre el uso de la plantilla descrita en las partes 3 y 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay dos pasos críticos en este protocolo que requieren especial atención para una exitosa implementación de plantilla 3D impresa para colocar los embriones de pez cebra.
El factor más importante en el diseño de la plantilla arraying es la captura. A hace que hay solamente un embrión en cada pocillo, uno debe prestar mucha atención al diámetro y la profundidad del pozo de atrapamiento y el diámetro del agujero a través. El diámetro recomendado es de 1.5 a 2 veces del diámetro de un …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el programa “1000plan”, los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Tongji y NSFC concesión # 21607115 y 21777116 (Lin).
Materials
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 – 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533 (2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
