Eine 3-dimensionale (3D)-gedruckte Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos anordnen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwerfen und fertigen eine zebrafischembryo Vorlage, gefolgt von ein detailliertes Verfahren für die Verwendung dieser Vorlage für hohen Durchsatz Zebrafish Embryos Anordnung in einer 96-Well-Platte anordnen.
Abstract
Der Zebrabärbling ist ein weltweit anerkannter Süßwasser Organismus häufig in Entwicklungsbiologie, Umwelttoxikologie und Krankheit beim Menschen verwandten Forschungsgebieten. Dank seiner einzigartigen Eigenschaften, einschließlich große Fruchtbarkeit, Embryo Transluzenz, schnelle und gleichzeitige Entwicklung, etc.Zebrafisch-Embryonen werden häufig verwendet für groß angelegte Toxizität Bewertung von Chemikalien und Drogen/Compound Screening. Eine typische Screening-Verfahren beinhaltet Erwachsenen Zebrafisch laichen, Embryonen Auswahl und Anordnung der Embryonen in Multi-well-Platten. Von dort aus Embryonen sind Belichtung und die Toxizität von Chemikalien ausgesetzt, oder die Wirksamkeit der Medikamente/Verbindungen kann relativ schnell anhand der phänotypischen Beobachtungen ausgewertet werden. Zwischen diesen Prozessen ist Embryonen anordnen eine zeitraubende und arbeitsintensive Schritte, die den Durchsatz begrenzt. In diesem Protokoll präsentieren wir ein innovatives Konzept, das macht die Verwendung einer 3D-gedruckten arraying Vorlage in Verbindung mit-Manipulation Vakuum um diesen mühsamen Schritt zu beschleunigen. Das Protokoll hierin beschreibt das Gesamtdesign der arraying Vorlage, eine detaillierte Versuchsaufbau und Schritt für Schritt Verfahren, gefolgt von repräsentative Ergebnisse. Bei der Implementierung sollte dieser Ansatz in einer Vielzahl von Anwendungen in der Forschung mit Zebrafisch-Embryonen als Tests Themen vorteilhaft.
Introduction
Als beliebter Modellorganismus ist in den Bereichen Medizin und Toxikologie1,2,3,4Zebrafisch verbreitet. Im Vergleich zu in-vitro- Plattformen, Zebrafisch bieten viel höherer biologischen Komplexität, dass ein oder zwei Zelltypen nicht bieten konnte. Abgesehen davon, dass ein Organismus, Modell, dem Zebrafisch-große Fruchtbarkeit, schnelle und gleichzeitige Embryonalentwicklung und hohen Orgel Transluzenz haben gegeben, dieses Modell einzigartige Vorteile für groß angelegte Toxizität oder Drogen/Verbund screening-5verwendet werden. Die Hunderte von Embryonen, die jede Woche von ein paar Erwachsene Zebrafisch produziert haben übertreffen alle anderen ganz Tiermodellen und es für Hochdurchsatz-Screening geeignet.
Eine typische Screening-Verfahren mit Zebrafisch beinhaltet eine erhebliche Menge an Handarbeit, wie Erwachsene Zebrafisch laichen, Embryo Auswahl und Anordnung von Embryonen in geeigneten Behältern, wo sie auf die Exposition durch Eintauchen in Wasser ausgesetzt sind. Die Entwicklung der Embryonen wird überwacht und beobachtbaren Endpunkte wie Sterblichkeit, Schlupfrate und Anomalie sind oft manuell ausgewertet und als vorläufige Identifikationen der Toxizität von Chemikalien oder Hinweise auf die Wirksamkeit der Drogen oder Verbindungen. Um die Screening-Verfahren zu beschleunigen, wurden zuvor Ansätze wie automatisierte Imaging- und computergestützte Bildanalyse untersucht. Beispielsweise wurden Mikroskope mit hohem Gehalt imaging-Funktionen führen Sie automatisierte Hellfeld oder Fluoreszenz-Bildgebung auf Zebrafish Embryos in verschiedenen Entwicklungsstadien von 96/384-well-Platten6angepasst. Mikrofluidische Geräte gepaart mit Mikroskopen dienten zebrafischlarven durch aktuellen Bearbeitung für die Bildgebung des Gehirns Neuronen7positionieren. Diese Ansätze könnten die Effizienz der Bild Akquisitionen im Vergleich zum traditionellen manuellen Betrieb erheblich verbessern. Darüber hinaus wurden mit großen Anzahl von Bildern erzeugt werden, Bild-Analyse-Tools auch entwickelt, um die Verarbeitung der Daten zu beschleunigen wie Liu Et Al. und Tu Et Al. zeigen 8 , 9.
Der Durchsatz der Bildverarbeitung und Bildanalyse erhöht, wurde es klar, dass die Bandbreitenbegrenzung Schritt für das Screening liegt in den Prozess der Exposition, die in der Regel bedeutet, wobei sie in 96 oder 384-Well-Platten Zebrafish Embryos vorbereiten. Um diesen Engpass Schritt zu lösen, Vision-geführte Robotik von Mandrell Et Al. entwickelt wurden 10 und uns11 zuvor, manuelle Handhabung aber die Instrumente zu ersetzen waren eher anspruchsvoll und es gibt eine Tiefe Lernkurve, solche Techniken umzusetzen. Daher bieten ein easy-to-Use-Ansatz ist ein wichtiger Faktor, der Durchsatz Zebrafisch-Screening weiter zu verbessern und das Hauptziel dieser Arbeit ist.
In dieser Arbeit wir konstruiert und gefertigt einen Embryo, die Vorlage von 3D-Druck anordnen. Eine arraying Vorlage wurde entwickelt, um Zebrafish Embryos in Vertiefungen, die mit einer standard 96-Well-Platte passen zu fangen. Anstelle von Embryonen auswählen und anordnen sie in einzelnen Brunnen eins nach dem anderen, könnte man Embryo Einschluss und Array alle 96 Embryonen in einem mehrlagigen Teller auf einmal durchführen. Mit dieser Vorlage und das folgende Protokoll, konnte man deutlich steigern die Effizienz der Embryonen in mehrlagigen Platten, die im Begriff Schub würde die Screening-Kapazität mindestens das Zehnfache, im Vergleich zu manuellen Betrieb anordnen. Die nachfolgend beschriebene Protokoll beinhaltet eine Gesamtkonzeption für die Anordnung der Vorlage, Zebrafisch laichen, Embryo-Sammlung und Anordnung. Abbildung 1 zeigt das gesamte Design der arraying Vorlage. Abbildung 2 zeigt eine Übersicht des Protokolls Schritt für Schritt über die Verwendung der Vorlage in den Teilen 3 und 4 beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt zwei wichtige Schritte in diesem Protokoll, die Aufmerksamkeit für eine erfolgreiche Umsetzung der 3D-Druck Vorlage erfordern für Anordnung Zebrafisch-Embryonen.
Der wichtigste Faktor auf die Gestaltung der arraying Vorlage ist die Einklemmung. Macht sicher gibt es nur einen Embryo in jedes gut gefangen, man sollte achten Sie besonders auf den Durchmesser und die Tiefe des Brunnens Verlockende Falle, und der Durchmesser der Durchgangsöffnung. Der empfohlene Durchmesser ist innerhalb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Jugendprogramm “1000plan”, die Startup-Fonds von der Tongji-Universität und NSFC Grant # 21607115 und 21777116 (Lin) unterstützt.
Materials
| Zebrafish Facility | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Mating box | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Wash Bottle, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Sodium chloride | Vetec | V900058-500G | |
| Potassium Chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Calcium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Sodium bicarbonate | Vetec | v900182-500G | |
| Methylene Blue Hydrate | TCI | M0501 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sea Salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipetter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Controlled Drop Pasteur Pipet | Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Biochemical incubator | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| 3D printer | UnionTech | Lite600 | |
| Photosensitive resin | UnionTech | UTR9000 | |
| Vacuum pump | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Solarbio | YA0245 | |
| 96 well plate | Costar | 3599 | |
| Multi 8-channel pipette 30 – 300 μl | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Compressed Gas Duster | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Drying oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System water | Water out of the facility’s water system | ||
| Egg water | Dilute 60mg “Instant Ocean” sea salts and 0.25 mg/L methylene blue in 1 L DI water | ||
| Holtfreter’s solution | Dissolve 7.0 g Sodium chloride (NaCl), 0.4 g Sodium bicarbonate (NaHCO3), 0.1 g Potassium Chloride (KCl), 0.235 g Calcium chloride (CaCl2.2H2O) in 1.9 L DI water. Adjust pH to 7 using HCl and adjust volume to 2 L using Di water |
References
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