ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור live-הדמיה של fluorescently שכותרתו קטעי רירית הרחם האנושי הושתל בעכברים. השיטה מאפשרת ללמוד את השפעות הסמים על גודל הנגע endometriotic באמצעות ניטור, כימות של זריחה הנפלטים על ידי הכתבת פלורסנט בזמן אמת

Abstract

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליישום מודל העכבר heterologous שבו ההתקדמות של אנדומטריוזיס יכול להיות מוערך בזמן אמת באמצעות ניטור לא פולשנית של זריחה הנפלטת מושתל חוץ רחמי רקמה רירית הרחם אנושית. למטרה זו, ביופסיות של רירית הרחם האנושי מתקבלים מתרומה oocyte מתמשך של התורם נשים. קטעי רירית הרחם אדם מתורבתים בנוכחות adenoviruses מתוכנן cDNA אקספרס עבור mCherry חלבון פלואורסצנטי הכתב. על ויזואליזציה, תוויות רקמות עם שיעור אופטימלית של קרינה פלואורסצנטית לאחר זיהום נבחרו לאחר מכן עבור ההשתלה בעכברים הנמען. שבוע לפני ניתוח ההשתלה, עכברים הנמענים הם oophorectomized, כדורי אסטרדיול ממוקמים subcutaneously לקיים את הישרדות וצמיחה של נגעים. ביום של הניתוח עכברים הם מרדימים, ואת הצפק חלל לגשת דרך חתך קטן (כ- 1.5 ס מ) על ידי לינאה-אלבה. שתלים fluorescently שכותרתו tweezed, בקצרה טבולים בדבק, מחוברת לשכבה הצפק. חתכים ומאחים והשאירו חיות להתאושש במשך כמה ימים. קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי שתלים endometriotic בדרך כלל לא פולשני מנוטר כל 3 ימים 4 שבועות עם מערכת הדמיה ויוו. וריאציות בגודל של endometriotic שתלים יכול להיות בזמן אמת לפי אומדן כימות של mCherry אות ו נורמליזציה נגד הראשונית הזמן נקודת-מציג עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקסימלי.

מכרסמים פרה המסורתי של מודלים של אנדומטריוזיס אינם מאפשרים פיקוח בלתי פולשני של הנגע בזמן אמת אבל מאפשר הערכת ההשפעות של תרופות לבדיקה על נקודת הקצה. פרוטוקול זה מאפשר לעקוב אחר נגעים בזמן אמת והוא שימושי יותר לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של תרופות במודלים פרה של אנדומטריוזיס. המגבלה העיקרית של המודל כך שנוצר הוא כי ניטור פולשני אינו אפשרי על פני תקופות זמן בשל ביטוי episomal של Ad-וירוס.

Introduction

אנדומטריוזיס היא מחלה כרונית גניקולוגיות שיזם ההשתלה של רירית הרחם פונקציונלי מחוץ חלל הרחם. חוץ רחמי נגעים גדלים, זירוז תהליכים דלקתיים שמוביל כרונית האגן כאב שרירים פוריות¹. ההערכה היא כי עד כדי 10 – 15% מהנשים בגיל הפריון הושפעו endometriosis2, זה קיים כ- 40%-50% של נשים עקרה³. טיפולים שוטפים תרופתי אנדומטריוזיס הינם מסוגל לחסל לחלוטין נגעים לא ללא תופעות לוואי^4,5. המחקר עבור טיפולים יעילים יותר מחייב של העידון של הדגמים בעלי חיים הקיים של אנדומטריוזיס באופן כזה כי יכול להיות חיקה כראוי האנושי נגעים, ההשפעות של תרכובות על גודל הנגע בין היתר יכול להידרש מקרוב.

פרימטים הדגמים השתמשו כדי לחקות אנדומטריוזיס מאת נגעים חוץ רחמי implanting זהה בהיסטולוגיה, באתרים דומים כמו בני אדם^6,7,8; עם זאת, חששות אתיים והעלויות כלכלית גבוהה קשורה ניסויים עם מגבלת פרימטים שלהם לשימוש⁹. כתוצאה מכך, השימוש של בעלי חיים קטנים, בעיקר מכרסמים, ליישום בבית-vivo מודלים של אנדומטריוזיס ימשיך להיות העדיף שכן היא מאפשרת לימודי עם מספר גדול של אנשים^10,11. אנדומטריוזיס יכול להיגרם בבעלי חיים אלה על ידי משתילים חתיכות של מכרסמים הרחם קרניים (“מודלים הומולוגיים”)^12,13 או רקמה רירית הרחם/endometriotic אנושית לאתרים חוץ רחמי (מודלים heterologous)¹⁴ . בניגוד לבני אדם, מכרסמים אל תזילו רקמת רירית הרחם שלהם, ובכך אנדומטריוזיס לא ניתן לפתח באופן ספונטני במינים אלו. לכן, העכבר הומולוגי מודלים של אנדומטריוזיס ננזף בשל העובדה כי מושתל רקמת הרחם חוץ רחמי העכבר אינו משקף את מאפייני האנושי נגעים endometriotic¹⁵.

פיזיולוגיה המתאים של אנדומטריוזיס יכול חיקה במודלים heterologous של אנדומטריוזיס איפה טריים האנושי קטעי רירית הרחם מושתלים לתוך חיות immunodeficient. במודלים heterologous המקובלת, ההשפעות הטיפוליות של תרכובות עניין הם בדרך כלל לאומדן בנקודת הקצה ההערכה של גודל הנגע בעזרת מחוגה¹⁶. מגבלה ברור הוא, ככזה, הקצה של מודלים בעלי חיים אינם מאפשרים לימוד הדינמיקה ההשתלה או התפתחות הנגע endometriotic לאורך זמן. מגבלה נוספת היא כי השימוש מחוגה אינו מאפשר מדידות מדויקות של גודל הנגע. אכן, שגיאת התקן שסופק על-ידי מחוגה הוא בטווח זהה (קרי, מילימטרים) כגודל של נגעים שהושתלו בעכברים, לפיכך הגבלת הקיבולת של כלים אלה כדי לזהות וריאציות בפועל בגודלם.

כדי להתגבר על מגבלות כאלה, במסמך זה, אנו מתארים את הדור של מודל heterologous העכבר של אנדומטריוזיס בו מושתל רקמה אנושית מתוכנן לבטא m-שרי כתב חלבון פלואורסצנטי. זיהוי של האות פלורסנט עם מערכת התמונה מאפשר בקרה בלתי פולשני של מצב הנגע באמצעות כימות בו זמנית הגודל שלה בזמן אמת. לפיכך, המודל שלנו מספק יתרונות משמעותיים בהשוואה למודלים קצה קונבנציונאלי כשהוא מחזיר את ההזדמנות של ניטור פולשני בזמן אמת ועל האפשרות לביצוע יותר אובייקטיבית, אומדן מדויק של וריאציות בגודל הנגע.

Protocol

השימוש של דגימות רקמה אנושית אושרה על ידי הועד המוסדי יו ר ועדת האתיקה של בית החולים Universitario La Fe. כל המטופלים מסופקים בכתב הסכמה מדעת. המחקר המערבות בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים מוסדיים ב ולנסיה סנטרו דה Investigacion פרינסיפה פליפה, כל ההליכים שבוצעו בעקבות הנחיות טיפול ושימוש י?…

Representative Results

כאן, אנו מתארים את התהליך ליצירת מודל heterologous של אנדומטריוזיס שבו הארכיטקטורה של נגעים נשמר על ידי השתלת fluorescently שכותרתו פיסות רירית הרחם אנושי לתוך immunocompromised עכברים, ובכך מאפשר לא פולשנית ניטור של התקדמות הנגע. תיוג של קטעי רירית הרחם מושגת על-ידי זיהום עם אדנו מתוכנן mCherry…

Discussion

פרוטוקול מפורט במסמך זה מתאר את היישום של מודל חיה של אנדומטריוזיס שבו נשמר את הארכיטקטורה של השתלת נגעים אדריכלות בזמן בו זמנית ומאפשר הערכה בזמן אמת של קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי mCherry מתויג רקמת רירית הרחם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש של מערכת הדמיה ויוו ספציפיות וכן תוכנו…

Materials

Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	—	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1000 mg/g	B-BRAUN	—	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	—	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	—	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	—	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	—	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	—	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator