رصد موسع لحجم الآفة في نموذج ماوس مغايرة لبطانة الرحم
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا للعيش-التصوير المسمى فلوريسسينتلي شظايا بطانة الرحم البشرية المطعمة في الفئران. يسمح الأسلوب دراسة آثار المخدرات الاختيار على حجم الآفة اندوميتريوتيك من خلال الرصد والقياس الكمي للأسفار التي تنبعث من المراسل الفلورسنت في الوقت الحقيقي
Abstract
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتنفيذ نموذج مغايرة الماوس التي يمكن تقييم تطور بطانة الرحم في الوقت الحقيقي من خلال رصد موسع للأسفار التي تنبعث من مزروع الأنسجة بطانة الرحم البشرية خارج الرحم. ولهذا الغرض، يتم الحصول على خزعات من بطانة الرحم البشرية من المانحين التبرع البويضيه الجارية المرأة. شظايا بطانة الرحم البشرية تستزرع حضور غدية هندسيا لكدنا صريحة مشري بروتين فلوري مراسل. على التصور، ويسمى الأنسجة بمعدل أمثل للأسفار بعد الإصابة في وقت لاحق المختارة لغرس في الفئران المستفيدة. أسبوع واحد قبل جراحة زرع، هي أووفوريكتوميزيد الفئران المستفيدة، والكريات استراديول توضع تحت الجلد للحفاظ على بقاء ونمو الآفات. اليوم لعملية جراحية الفئران تجويف تخديره، والبريتوني الوصول إليها من خلال شق صغيرة (1.5 سم) لينيا-ألبا. يزرع المسمى فلوريسسينتلي تويزيد، بإيجاز غارقة في الغراء وتعلق على طبقة البريتوني. يتم خياطة الشقوق، وترك الحيوانات لاسترداد لبضعة أيام. ويرصد fluorescence المنبعثة من يزرع اندوميتريوتيك عادة غير-إينفاسيفيلي كل 3 أيام لمدة 4 أسابيع مع نظام تصوير في الحية. ويمكن تقدير الاختلافات في الحجم من يزرع اندوميتريوتيك في الوقت الحقيقي بالتحديد الكمي للإشارات مشري والتطبيع ضد الزمن-النقطة الأولى تبين كثافة fluorescence القصوى.
القوارض السريرية التقليدية لنماذج من بطانة الرحم عدم السماح برصد غير الغازية للآفة في الوقت الحقيقي ولكن بدلاً من ذلك السماح بتقييم لآثار المخدرات جزيئي عند نقطة النهاية. هذا البروتوكول يسمح أحد لتتبع الآفات في الوقت الحقيقي، وهو أكثر فائدة لاستكشاف إمكانات العلاج من المخدرات في نماذج السريري لالتهاب بطانة الرحم. القيد الرئيسي للنموذج وهكذا ولدت أن الرصد غير الغازية من غير الممكن على مدى فترات طويلة من الوقت بسبب التعبير ابيسومال من الفيروسات الإعلانية.
Introduction
بطانة الرحم اضطراب الجهاز التناسلي للمرأة مزمنة بدأت بغرس الوظيفية بطانة الرحم خارج تجويف الرحم. تنمو الآفات حمل خارج الرحم والحث على التهابات العمليات المؤدية إلى المزمنة الألم والعقم الحوض1. ومن المقدر أن يصل إلى 10-15% نساء في سن الإنجاب تتأثر endometriosis2، وأنها موجودة في حوالي 40-50% من النساء المصابات بالعقم3. العلاجات الدوائية الحالية لبطانة الرحم غير قادر على القضاء التام على آفات ولا يخلو من الآثار الجانبية4،5. يتطلب البحث عن علاجات أكثر فعالية لتحسين النماذج الحيوانية الموجودة في بطانة الرحم بطريقة يمكن أن تحاكي آفات البشرية على نحو ملائم، ويمكن تقييم آثار المركبات على حجم الآفة بين أمور أخرى عن كثب.
وقد استخدمت نماذج الرئيسيات لتقليد بطانة الرحم بترسيخ آفات حمل خارج الرحم الأشيع متطابقة وفي مواقع مماثلة كما هو الحال في البشر6،،من78؛ ومع ذلك، الشواغل الأخلاقية وارتفاع التكاليف الاقتصادية المتصلة بالتجريب مع حد الرئيسات استخدام9. ونتيجة لذلك، لا يزال استخدام الحيوانات الصغيرة، ولا سيما من القوارض، لتنفيذ نماذج فيفو من بطانة الرحم تكون يفضل أنها تتيح دراسات مع عدد أكبر من الأفراد10،11. بطانة الرحم يمكن أن يتسبب في هذه الحيوانات بزرع قطعة من القوارض ابواق الرحم (“نماذج مثلى”)،من1213 أو أنسجة بطانة الرحم/اندوميتريوتيك البشرية إلى مواقع خارج الرحم (نماذج مغايرة)14 . وعلى النقيض من البشر، القوارض لا تسلط على أنسجة بطانة الرحم ومما بطانة الرحم يمكن عدم وضع تلقائياً في هذه الأنواع. ولذلك، الماوس مثلى نماذج من بطانة الرحم قد تعرض للانتقاد يرجع ذلك إلى حقيقة أن زرع أنسجة الرحم الماوس حمل خارج الرحم لا تعكس خصائص الآفات اندوميتريوتيك البشرية15.
يمكن أن تحاكي المناسبة فسيولوجيا بطانة الرحم في نماذج مغايرة لبطانة الرحم حيث يتم زرع شظايا بطانة الرحم البشرية الطازجة في الحيوانات العوز. في نماذج مغايرة التقليدية، يتم عادة تقييم الآثار العلاجية من المركبات ذات الأهمية عند نقطة النهاية بتقييم حجم الآفة باستخدام الفرجار16. حد واضح، على هذا النحو، نماذج حيوانية نقطة النهاية لا تسمح دراسة ديناميات غرس أو تطور الآفة اندوميتريوتيك على مر الزمن. قيداً إضافيا أن لا تسمح باستخدام الفرجار القياسات الدقيقة لحجم الآفة. وفي الواقع، الخطأ القياسي تقدمها الفرجار في نفس النطاق (أي، ملليمتر) كحجم الآفات مزروع في الفئران، مما يحد من قدرة هذه الأدوات للكشف عن التغيرات الفعلية في الحجم.
وللتغلب على هذه القيود، هنا، يصف لنا توليد نموذج الماوس مغايرة لبطانة الرحم التي تم تصميم مزروع الأنسجة البشرية للتعبير عن كرز م مراسل بروتين فلوري. يمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت مع نظام صورة مناسبة غير الغازية رصد حالة الآفة مع الكمي المتزامن لحجمه في الوقت الحقيقي. وهكذا، لدينا نموذج يوفر مزايا واضحة عند مقارنة النماذج التقليدية نقطة النهاية كما أنه يجلب الفرصة للرصد في الوقت الحقيقي غير الغازية وإمكانية أداء أكثر موضوعية وتقدير دقيق للتغيرات في حجم الآفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف البروتوكول هنا بالتفصيل تنفيذ نموذج الحيوان من بطانة الرحم التي يتم الاحتفاظ بنية غرس العمارة الآفات بينما يسمح في نفس الوقت تقييم الوقت الحقيقي للأسفار تنبعث حسب مشري المسمى أنسجة بطانة الرحم. في هذا البروتوكول، يصف لنا استخدام محددة المجراة في نظام التصوير والبرامج ذات الصلة لتقي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية من خلال برنامج سيرفيت ميغيل [CP13/00077] تأسيسه قبل FEDER (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبية) الإسبانية ومنحت للدكتور ر. غوميز إلى جانب المنح “معهد كارلوس الثالث للصحة” الدكتور R غوميز [PI14/00547 و PI17/02329] وزين ألف كانو [PI12/02582].
Materials
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
- Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. Pathogenesis of endometriosis. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 18, 233-244 (2004).
- Holoch, K. J., Lessey, B. A. Endometriosis and infertility. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).
- Eskenazi, B., Warner, M. L. Epidemiology of endometriosis. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).
- Giudice, L. C., Kao, L. C. Endometriosis. Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).
- Donnez, J., et al. The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain. Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).
- D’Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus). Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).
- Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony. Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).
- Donnez, O., et al. Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions. Fertility & Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).
- Grummer, R. Animal models in endometriosis research. Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).
- Rossi, G., et al. Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression. Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).
- Grummer, R., et al. Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model. Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).
- Becker, C. M., et al. A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy. The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).
- Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions. The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).
- Nap, A. W., et al. Antiangiogenesis therapy for endometriosis. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).
- Wang, C. C., et al. Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice. Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).
- Delgado-Rosas, F., et al. The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis. Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).
- Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 197 (6), 578 (2007).
- Fortin, M., et al. Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis. Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).
- Liu, B., et al. Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).
- Wang, N., et al. A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method. European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).
