כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור live-הדמיה של fluorescently שכותרתו קטעי רירית הרחם האנושי הושתל בעכברים. השיטה מאפשרת ללמוד את השפעות הסמים על גודל הנגע endometriotic באמצעות ניטור, כימות של זריחה הנפלטים על ידי הכתבת פלורסנט בזמן אמת
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליישום מודל העכבר heterologous שבו ההתקדמות של אנדומטריוזיס יכול להיות מוערך בזמן אמת באמצעות ניטור לא פולשנית של זריחה הנפלטת מושתל חוץ רחמי רקמה רירית הרחם אנושית. למטרה זו, ביופסיות של רירית הרחם האנושי מתקבלים מתרומה oocyte מתמשך של התורם נשים. קטעי רירית הרחם אדם מתורבתים בנוכחות adenoviruses מתוכנן cDNA אקספרס עבור mCherry חלבון פלואורסצנטי הכתב. על ויזואליזציה, תוויות רקמות עם שיעור אופטימלית של קרינה פלואורסצנטית לאחר זיהום נבחרו לאחר מכן עבור ההשתלה בעכברים הנמען. שבוע לפני ניתוח ההשתלה, עכברים הנמענים הם oophorectomized, כדורי אסטרדיול ממוקמים subcutaneously לקיים את הישרדות וצמיחה של נגעים. ביום של הניתוח עכברים הם מרדימים, ואת הצפק חלל לגשת דרך חתך קטן (כ- 1.5 ס מ) על ידי לינאה-אלבה. שתלים fluorescently שכותרתו tweezed, בקצרה טבולים בדבק, מחוברת לשכבה הצפק. חתכים ומאחים והשאירו חיות להתאושש במשך כמה ימים. קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי שתלים endometriotic בדרך כלל לא פולשני מנוטר כל 3 ימים 4 שבועות עם מערכת הדמיה ויוו. וריאציות בגודל של endometriotic שתלים יכול להיות בזמן אמת לפי אומדן כימות של mCherry אות ו נורמליזציה נגד הראשונית הזמן נקודת-מציג עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקסימלי.
מכרסמים פרה המסורתי של מודלים של אנדומטריוזיס אינם מאפשרים פיקוח בלתי פולשני של הנגע בזמן אמת אבל מאפשר הערכת ההשפעות של תרופות לבדיקה על נקודת הקצה. פרוטוקול זה מאפשר לעקוב אחר נגעים בזמן אמת והוא שימושי יותר לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של תרופות במודלים פרה של אנדומטריוזיס. המגבלה העיקרית של המודל כך שנוצר הוא כי ניטור פולשני אינו אפשרי על פני תקופות זמן בשל ביטוי episomal של Ad-וירוס.
אנדומטריוזיס היא מחלה כרונית גניקולוגיות שיזם ההשתלה של רירית הרחם פונקציונלי מחוץ חלל הרחם. חוץ רחמי נגעים גדלים, זירוז תהליכים דלקתיים שמוביל כרונית האגן כאב שרירים פוריות1. ההערכה היא כי עד כדי 10 – 15% מהנשים בגיל הפריון הושפעו endometriosis2, זה קיים כ- 40%-50% של נשים עקרה3. טיפולים שוטפים תרופתי אנדומטריוזיס הינם מסוגל לחסל לחלוטין נגעים לא ללא תופעות לוואי4,5. המחקר עבור טיפולים יעילים יותר מחייב של העידון של הדגמים בעלי חיים הקיים של אנדומטריוזיס באופן כזה כי יכול להיות חיקה כראוי האנושי נגעים, ההשפעות של תרכובות על גודל הנגע בין היתר יכול להידרש מקרוב.
פרימטים הדגמים השתמשו כדי לחקות אנדומטריוזיס מאת נגעים חוץ רחמי implanting זהה בהיסטולוגיה, באתרים דומים כמו בני אדם6,7,8; עם זאת, חששות אתיים והעלויות כלכלית גבוהה קשורה ניסויים עם מגבלת פרימטים שלהם לשימוש9. כתוצאה מכך, השימוש של בעלי חיים קטנים, בעיקר מכרסמים, ליישום בבית-vivo מודלים של אנדומטריוזיס ימשיך להיות העדיף שכן היא מאפשרת לימודי עם מספר גדול של אנשים10,11. אנדומטריוזיס יכול להיגרם בבעלי חיים אלה על ידי משתילים חתיכות של מכרסמים הרחם קרניים (“מודלים הומולוגיים”)12,13 או רקמה רירית הרחם/endometriotic אנושית לאתרים חוץ רחמי (מודלים heterologous)14 . בניגוד לבני אדם, מכרסמים אל תזילו רקמת רירית הרחם שלהם, ובכך אנדומטריוזיס לא ניתן לפתח באופן ספונטני במינים אלו. לכן, העכבר הומולוגי מודלים של אנדומטריוזיס ננזף בשל העובדה כי מושתל רקמת הרחם חוץ רחמי העכבר אינו משקף את מאפייני האנושי נגעים endometriotic15.
פיזיולוגיה המתאים של אנדומטריוזיס יכול חיקה במודלים heterologous של אנדומטריוזיס איפה טריים האנושי קטעי רירית הרחם מושתלים לתוך חיות immunodeficient. במודלים heterologous המקובלת, ההשפעות הטיפוליות של תרכובות עניין הם בדרך כלל לאומדן בנקודת הקצה ההערכה של גודל הנגע בעזרת מחוגה16. מגבלה ברור הוא, ככזה, הקצה של מודלים בעלי חיים אינם מאפשרים לימוד הדינמיקה ההשתלה או התפתחות הנגע endometriotic לאורך זמן. מגבלה נוספת היא כי השימוש מחוגה אינו מאפשר מדידות מדויקות של גודל הנגע. אכן, שגיאת התקן שסופק על-ידי מחוגה הוא בטווח זהה (קרי, מילימטרים) כגודל של נגעים שהושתלו בעכברים, לפיכך הגבלת הקיבולת של כלים אלה כדי לזהות וריאציות בפועל בגודלם.
כדי להתגבר על מגבלות כאלה, במסמך זה, אנו מתארים את הדור של מודל heterologous העכבר של אנדומטריוזיס בו מושתל רקמה אנושית מתוכנן לבטא m-שרי כתב חלבון פלואורסצנטי. זיהוי של האות פלורסנט עם מערכת התמונה מאפשר בקרה בלתי פולשני של מצב הנגע באמצעות כימות בו זמנית הגודל שלה בזמן אמת. לפיכך, המודל שלנו מספק יתרונות משמעותיים בהשוואה למודלים קצה קונבנציונאלי כשהוא מחזיר את ההזדמנות של ניטור פולשני בזמן אמת ועל האפשרות לביצוע יותר אובייקטיבית, אומדן מדויק של וריאציות בגודל הנגע.
פרוטוקול מפורט במסמך זה מתאר את היישום של מודל חיה של אנדומטריוזיס שבו נשמר את הארכיטקטורה של השתלת נגעים אדריכלות בזמן בו זמנית ומאפשר הערכה בזמן אמת של קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי mCherry מתויג רקמת רירית הרחם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש של מערכת הדמיה ויוו ספציפיות וכן תוכנו…
The authors have nothing to disclose.
העבודה הזאת הייתה נתמך על ידי ספרדית משרד הכלכלה ואת התחרותיות באמצעות התוכנית Servet מיגל [CP13 00077] הקים על ידי פדר (קרן פיתוח אזורי אירופה), זכה ד ר ר גומז כמו גם על ידי קרלוס השלישי המכון לבריאות מענקים ד ר גומז R [PI14/00547, PI17/02329], פרופ ‘ / ח’ א קאנו [PI12 02582].
Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |