Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für live-Aufnahmen von Eindringmittel beschriftete menschliche endometrialen Fragmente bei Mäusen verpflanzt. Die Methode ermöglicht das untersuchen die Auswirkungen der Medikamente der Wahl auf die Größe der nichtmalignem Läsion durch Überwachung und Quantifizierung der Fluoreszenz emittiert von fluoreszierenden Reporter in Echtzeit
Abstract
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Durchführung einer heterologen Mausmodell, in dem Fortschreiten der Endometriose in Echtzeit durch eine nicht-invasive Überwachung der Fluoreszenz emittiert von implantierten ektopische menschlichen endometrial Gewebes beurteilt werden kann. Zu diesem Zweck werden Spender Frauen laufenden Eizellspende Biopsien des menschlichen Endometrium entnommen. Menschlichen endometrialen Fragmente sind im Beisein von Adenoviren entwickelt, um ausdrückliche cDNA für Reporter fluoreszierendes Protein mCherry kultiviert. Bei der Visualisierung beschriftet Gewebe mit einer optimalen Rate der Fluoreszenz nach Infektion werden anschließend für die Implantation im Empfänger Mäuse ausgewählt. Eine Woche vor der Implantation Operation Empfänger Mäuse oophorectomized und Estradiol Pellets sind subkutan aufgestellt, um das Überleben und Wachstum der Läsionen aufrecht zu erhalten. Am Tag der Operation sind Mäuse narkotisierten und peritonealen Hohlraum erreicht durch einen kleinen (1,5 cm) Schnitt durch die Linea Alba. Eindringmittel beschrifteten Implantate sind tweezed, kurz in Klebstoff getränkt und die peritoneale Schicht an. Einschnitte vernäht, und Tiere übrig, um für ein paar Tage zu erholen. Fluoreszenz emittierten nichtmalignem Implantate wird in der Regel nicht-invasiv alle 3 Tage für 4 Wochen mit einer in-vivo imaging-System überwacht. Variationen in der Größe von nichtmalignem Implantaten können in Echtzeit durch Quantifizierung des mCherry Signal und Normalisierung gegen die anfängliche Zeit-Punkt zeigen maximale Fluoreszenzintensität geschätzt werden.
Traditionelle präklinischen Nagetiere von Modellen der Endometriose nicht erlauben, nicht-invasive Überwachung der Läsion in Echtzeit aber eher erlauben Bewertung der Auswirkungen von Drogen am Endpunkt untersucht. Dieses Protokoll ermöglicht es, Läsionen in Echtzeit verfolgen und ist nützlicher, das therapeutische Potenzial von Drogen in präklinischen Modellen der Endometriose zu erkunden. Die wichtigste Einschränkung des so erzeugten Modells ist, dass nicht-invasives monitoring über längere Zeit wegen der episomal Ausdruck des Ad-Virus nicht möglich ist.
Introduction
Endometriose ist eine chronische gynäkologische Erkrankung, initiiert durch die Implantation der funktionellen Gebärmutterschleimhaut außerhalb der Gebärmutterhöhle. Ektopische Läsionen wachsen und entzündliche Prozessen führt zu chronischen Becken-Schmerz und Unfruchtbarkeit1zu induzieren. Es wird geschätzt, dass bis zu 10 – 15 % der Frauen im gebärfähigen Alter von endometriosis2 betroffen sind, und es ist in ca. 40 – 50 % der unfruchtbaren Frauen3. Aktuellen pharmakologische Behandlungen für Endometriose sind nicht in der Lage, vollständig auszurotten Läsionen und nicht frei von Nebenwirkungen4,5. Die Forschung für eine effizientere Therapien braucht der Verfeinerung von bestehenden Tiermodellen der Endometriose in einer Weise, dass menschliche Läsionen können entsprechend nachgeahmt, und die Auswirkungen der Verbindungen auf die Größe der Läsion unter anderem genau beurteilt werden können.
Primas Modelle wurden verwendet, um die Endometriose zu imitieren, durch Implantation ektopische Läsionen, die histologisch identisch und an ähnlichen Standorten wie in Menschen6,7,8; jedoch im Zusammenhang mit ethische Bedenken und der hohen volkswirtschaftliche Kosten experimentieren mit Primaten Begrenzung ihrer Verwendung-9. Daher weiterhin die Verwendung von kleinen Tieren, vor allem Nagetiere, für die Umsetzung von in Vivo Modellen der Endometriose bevorzugt werden, da es Studien mit einer größeren Anzahl von Personen10,11erlaubt. Endometriose kann bei diesen Tieren induziert werden, durch die Transplantation entweder Stücke von Nagetier uterine Hörner (“homologe Modelle”)12,13 oder menschlichen Endometrium/nichtmalignem Gewebe, ektopische Websites (heterologe Modelle)14 . Im Gegensatz zu Menschen Nager ihre endometrial Gewebes nicht vergossen und somit Endometriose nicht entwickelt werden kann spontan in dieser Arten. Homologe Maus, die Modelle der Endometriose kritisiert wurden die ektopische Maus uterine Gewebe implantiert spiegelt daher nicht die Eigenschaften des menschlichen nichtmalignem Läsionen15.
Entsprechende Physiologie der Endometriose kann in die heterologe Modelle der Endometriose nachgeahmt werden, wo frische menschliche endometrialen Fragmente immungeschwächte Tiere implantiert werden. In herkömmlichen heterologen Modellen werden die therapeutischen Wirkungen von Verbindungen des Interesses häufig am Endpunkt durch die Beurteilung der Größe der Läsion mit dem Einsatz von Bremssättel16bewertet. Eine offensichtliche Einschränkung ist, dass als solche Endpunkt Tiermodelle nicht zulassen Implantation Dynamik oder nichtmalignem Läsion Entwicklung im Laufe der Zeit zu studieren. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Verwendung der Bremssättel genaue Messungen der Größe der Läsion nicht zulässt. In der Tat ist der Standardfehler von Bremssättel zur Verfügung gestellt in der gleichen Größenordnung wie die Größe der Läsionen implantiert bei Mäusen, so beschränken die Kapazität dieser Werkzeuge, tatsächliche Abweichungen in der Größe zu erkennen (z.B. Millimeter).
Um solche Einschränkungen zu überwinden, beschreiben wir hier die Generation der heterologen Mausmodell der Endometriose in der implantiertes menschlichen Gewebe entwickelt, um ein Reporter m-Cherry fluoreszierende Protein zum Ausdruck bringen. Erkennung von das Fluoreszenzsignal mit einem entsprechenden Image-System ermöglicht nichtinvasive Überwachung der Läsion Status mit gleichzeitige Quantifizierung dieser Größe in Echtzeit. So sieht unser Modell klare Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Endpunkt Modelle wie es bringt die Möglichkeit, nicht-invasive Überwachung in Echtzeit und die Möglichkeit, weitere Objektive und präzise Einschätzung der Variationen in Größe der Läsion führen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll hier detailliert beschreibt die Umsetzung von einem Tiermodell der Endometriose in die Architektur der Implantation Läsionen Architektur bewahrt wird während gleichzeitig ermöglicht Echtzeit-Bewertung der Fluoreszenz emittiert durch mCherry mit der Bezeichnung endometrial Gewebes. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines speziellen in-vivo imaging-System und zugehöriger Software nicht-invasiv Fluoreszenz emittierten die beschrifteten Läsion einzuschätzen. Jeder Benutzer sollte das Prot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit durch Miguel Servet Programm [CP13/00077] mitgegründet von FEDER (europäischer Fonds für regionale Entwicklung) und Dr. R. Gómez sowie von Carlos III Institute of Health Stipendien vergeben Dr R Gómez [PI14/00547 und PI17/02329] und Prof. A. Cano [PI12/02582].
Materials
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
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