子宫内膜异位症异种小鼠病变大小的无创监测
Summary
在这里, 我们提出了一个方案的现场成像荧光标记的人子宫内膜片段移植到小鼠。该方法通过实时监测和定量荧光记者发出的荧光, 研究选择的药物对子宫内膜异位细胞病变大小的影响
Abstract
在这里, 我们描述了一个协议, 实现了一个异源小鼠模型, 其中子宫内膜异位症的进展可以通过无创监测所植入的异位人类子宫内膜组织发出的荧光实时评估。为此, 从正在进行的卵母细胞捐献的供体妇女身上获得人体子宫内膜活检。人类子宫内膜片段是在腺病毒存在的情况下培养的, 这些腺病毒的设计是为了表达 cdna, 为报告荧光蛋白 mcherry。在可视化之后, 在接受者小鼠的植入中选择感染后荧光率最佳的标记组织。植入手术前一周, 受者小鼠被进行卵巢切除, 雌二醇颗粒被皮下放置, 以维持病变的存活和生长。手术当天, 小鼠被麻醉, 腹膜腔通过一个小 (1.5 厘米) 的切口通过线-阿尔巴进入.荧光标记的植入物被推状, 短暂浸泡在胶水中, 并附着在腹膜层。对氯感进行缝合, 动物离开后恢复几天。子宫内膜异位植入物发出的荧光通常每3天通过体内成像系统进行为期4周的非侵入性监测。通过对 mcherry 信号进行定量和对显示最大荧光强度的初始时间点的归一化, 可以实时估计子宫内膜植入物大小的变化。
子宫内膜异位症模型的传统临床前啮齿类动物不允许对病变进行实时非侵入性监测, 而是允许评估在终点检测的药物的效果。该方案允许一个人实时跟踪病变, 更有助于探索药物在子宫内膜异位症临床前模型中的治疗潜力。由此产生的模型的主要局限性是, 由于 Ad-virus 的会代表达, 非侵入性监测不可能长期进行。
Introduction
子宫内膜异位症是一种慢性妇科疾病, 由子宫腔外功能性子宫内膜的植入引起。异位病变生长和诱发炎症过程, 导致慢性盆腔疼痛和不孕1。据估计, 多达10-15% 的育龄妇女受到子宫内膜异位症2的影响, 大约40-50% 的不孕妇女存在。目前子宫内膜异位症的药物治疗不能完全根除病变, 不具有副作用4,5。更有效的治疗方法的研究要求完善现有的子宫内膜异位症动物模型, 使人类病变可以被适当地模仿, 化合物对病变大小的影响等可以仔细评估。
灵长类动物模型已被用来模仿子宫内膜异位症植入异位病变组织学上相同, 并在类似的地点, 在人类6,7,8;然而, 与灵长类动物试验有关的伦理问题和高昂的经济成本限制了它们的使用。因此, 使用小动物, 特别是啮齿类动物, 实施子宫内膜异位症的体内模型继续受到青睐, 因为它允许对更多的人进行研究 10,11。子宫内膜异位症可以诱导这些动物通过移植到异位点 (异质模型)12, 13 或人类子宫内膜子宫内膜异位体组织 (异质模型) 12, 或人类子宫内膜子宫内膜异位体组织 14.与人类不同的是, 啮齿类动物不会脱落其子宫内膜组织, 因此子宫内膜异位症不能在这些物种中自发发展。因此, 同种异体子宫内膜异位症模型因植入异位小鼠子宫肌组织的事实而受到批评, 不能反映人类子宫内膜异位症病变的特点15。
子宫内膜异位症的适当生理可在异种子宫内膜异位症模型中进行模拟, 在这些模型中, 新鲜的人子宫内膜片段被植入免疫缺陷的动物体内。在传统的异源模型中, 通常通过使用卡钳16评估病变大小来评估感兴趣的化合物的治疗效果。一个明显的局限性是, 因此, 端点动物模型不允许研究植入动力学或子宫内膜异位症病变的发展随着时间的推移。另一个限制是, 使用卡钳不允许准确测量病变大小。事实上, 卡钳提供的标准误差与小鼠植入病变的大小在相同的范围 (即毫米), 从而限制了这些工具检测大小实际变化的能力。
为了克服这些限制, 本文描述了子宫内膜异位症的异源小鼠模型的产生, 在该模型中植入人体组织的工程来表达记者 m-cherry 荧光蛋白。通过适当的图像系统检测荧光信号, 可以对病变状态进行非侵入性监测, 同时实时量化其大小。因此, 与传统端点模型相比, 我们的模型提供了明显的优势, 因为它带来了实时非侵入性监测的机会, 并有可能对病变大小的变化进行更客观、更准确的估计。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文详细介绍了子宫内膜异位症动物模型的实施情况, 在该模型中, 植入病变结构的结构得以保存, 同时允许实时评估 mcherry 发出的荧光标记的子宫内膜组织。在这个协议中, 我们描述了使用一个特定的体内成像系统和相关软件, 以非侵入性评估荧光发射的标记病变。每个用户都应根据其机构提供的特定成像设备和相关软件调整协议。通过将异氟烷气体麻醉机与体内成像系统结合, 在麻醉动物身上进?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了西班牙经济和竞争力部的支持, 该方案得到了 miguel servet 方案的支持, 该方案由欧洲区域发展基金 (feder) 共同发起, 并颁发给了 r. gómez 博士以及卡洛斯三世卫生研究所颁发的赠款给 r gómez 博士 [pi14/00547 和 pi17/12329] 和 a. cano 教授 [PI14/00547]。
Materials
| Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
| DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
| PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
| Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
| Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
| Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
| Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
| Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
| Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
| Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
| Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
| Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
| 96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
| Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
| Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
| Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
| Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
| Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
| Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
| Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
| Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
| Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |
References
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