Hier presenteren we een protocol voor live-imaging van fluorescently geëtiketteerde menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten geënt in muizen. De methode kunt bestuderen van de gevolgen van de drugs van keuze voor endometriotic laesie grootte door middel van controle en kwantificering van de fluorescentie die wordt uitgestoten door de fluorescerende verslaggever op real-time
Hier beschrijven we een protocol voor de uitvoering van een heteroloog muismodel waarin progressie van endometriose kan worden beoordeeld in real time via noninvasive monitoring van fluorescentie uitgestoten door geïmplanteerde ectopische menselijke baarmoederslijmvlies weefsel. Voor dit doel worden Biopten van menselijke endometrium donor vrouwen lopende oöcyt donatie verkregen. Menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten worden gekweekt in aanwezigheid van adenovirussen ontworpen om uitdrukkelijke cDNA voor de verslaggever fluorescent proteïne mCherry. Label op visualization, weefsels met een optimale tarief van fluorescentie na infectie worden vervolgens gekozen voor de implantatie in ontvangende muizen. Een week voorafgaand aan de implantatie-operatie, ontvangende muizen zijn oophorectomized en estradiol pellets subcutaan worden geplaatst om de overleving en de groei van de laesies. Op de dag van de operatie zijn muizen narcose en peritoneale holte benaderd via een kleine (1,5 cm) incisie door de linea-alba. Fluorescently geëtiketteerde implantaten zijn tweezed, kort gedrenkt in lijm en gekoppeld aan de peritoneale laag. Insnijdingen zijn ingehecht en dieren verlaten om te herstellen voor een paar dagen. Fluorescentie uitgestoten door endometriotic implantaten is meestal niet-gebeurt elke 3 dagen voor 4 weken met een in vivo imaging systeem gecontroleerd. Variaties in de grootte van endometriotic implantaten kunnen worden geraamd in real-time door de kwantificering van de mCherry signaal en de normalisatie tegen het oorspronkelijke tijd-punt maximale fluorescentie intensiteit tonen.
Traditionele preklinische knaagdieren van modellen van endometriose staan geen niet-invasieve monitoring van de laesie in real-time maar eerder toe evaluatie van de effecten van drugs vehiculumcontrolegroep op het eindpunt. Dit protocol maakt het mogelijk om bij te houden van de laesies in real-time en meer nuttig kunnen de therapeutische mogelijkheden van drugs in preklinische modellen van endometriose. De belangrijkste beperking van de aldus opgewekte model is dat niet-invasieve toezicht niet mogelijk gedurende lange perioden van tijd als gevolg van de episomal uitdrukking van Ad-virus is.
Endometriose is een chronische gynecologic disorder, geïnitieerd door de inplanting van het functionele baarmoederslijmvlies buiten de baarmoederholte. Ectopische laesies groeien en veroorzaken van inflammatoire processen die leiden tot chronische bekken pijn en onvruchtbaarheid1. Geschat wordt dat omhoog tot 10 – 15% van de vrouwen in de reproductieve leeftijd worden beïnvloed door endometriosis2, en het is aanwezig in ongeveer 40-50% van onvruchtbare vrouwen3. Huidige farmacologische behandelingen voor endometriose zijn niet in staat om volledig uit te roeien laesies en niet vrij van bijwerkingen4,5. Het onderzoek voor meer efficiënte therapieën vereist van de verfijning van de bestaande diermodellen van endometriose op zodanige wijze dat menselijke laesies op de juiste wijze kunnen worden geïmiteerd, en de effecten van verbindingen op de grootte van de laesie o.a. nauw kunnen worden beoordeeld.
Primate modellen zijn gebruikt om na te bootsen endometriose door het inplanteren van ectopische laesies histologisch identiek en op vergelijkbare sites zoals mensen6,7,8; echter, ethische bezwaren en de hoge economische kosten in verband met experimenten met primaten limiet hun gebruik9. Bijgevolg blijft het gebruik van kleine dieren, vooral knaagdieren, voor de uitvoering van in vivo modellen van endometriose worden begunstigd omdat het zorgt studies met grotere aantallen personen10,11. Endometriose kan in deze dieren worden opgewekt door het transplanteren van stukken van knaagdier baarmoeder horens (“homologe modellen”)12,13 of menselijk baarmoederslijmvlies/endometriotic weefsel naar ectopische sites (heterologe modellen)14 . In tegenstelling tot mensen, knaagdieren doen hun baarmoederslijmvlies weefsel niet vergoten en daardoor endometriose kan niet worden ontwikkeld spontaan in deze soorten. Homologe muis modellen van endometriose hebben bekritiseerd vanwege het feit dat ectopische muis uteriene weefsel ingeplant weerspiegelen derhalve niet de kenmerken van menselijke endometriotic laesies15.
Passende fysiologie van endometriose kan worden geïmiteerd in de heterologe modellen van endometriose waar verse menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten immunodeficiëntie dieren zijn ingeplant. Conventionele heterologe modellen, worden de therapeutische effecten van verbindingen van belang vaak beoordeeld op het eindpunt van de beoordeling van de grootte van de laesie met het gebruik van de remklauwen16. Een duidelijke beperking is dat, als zodanig, eindpunt diermodellen niet toestaan studeren implantatie dynamics of endometriotic laesie ontwikkeling na verloop van tijd. Een extra beperking is dat het gebruik van de remklauwen niet nauwkeurige metingen van de grootte van de laesie toelaat. Inderdaad, de standaardfout geboden door remklauwen is in hetzelfde bereik (dat wil zeggen, millimeters) als de omvang van de letsels geïmplanteerd in muizen, dus de beperking van de capaciteit van deze hulpprogramma’s te detecteren van werkelijke variaties in grootte.
Om deze beperkingen te overwinnen, hierin beschrijven we de generatie van een heteroloog muismodel van endometriose waarin geïmplanteerde menselijk weefsel is ontworpen om uit te drukken een verslaggever m-Cherry fluorescent proteïne. Detectie van het fluorescerende signaal met een passende afbeelding-systeem maakt het mogelijk niet-invasieve monitoring van de status van de laesie met gelijktijdige kwantificering van het formaat in real-time. Ons model biedt dus duidelijke voordelen in vergelijking met conventionele eindpunt modellen, aangezien het de mogelijkheid van bewaking in real-time niet-invasieve en de mogelijkheid voor het uitvoeren van meer objectieve en nauwkeurige schatting van de variaties in de grootte van de laesie brengt.
Het protocol hierin gedetailleerde beschrijving van de implementatie van een dierlijk model van endometriose waarin de architectuur van het implanteren van laesies het platform is bewaard terwijl tegelijkertijd waardoor real-time beoordeling van de fluorescentie uitgestoten door mCherry Label baarmoederslijmvlies weefsel. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een specifieke in vivo imaging systeem en verwante software te beoordelen niet-gebeurt fluorescentie uitgestoten door de gelabelde laesie. Elke gebruiker m…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van economie en het concurrentievermogen door de Miguel Servet programma [CP13/00077] samen door het EFRO (Europees Fonds voor regionale ontwikkeling) en toegekend aan Dr. R. Gómez alsmede door Carlos III Institute of Health toegekende subsidies Dr. R Gómez [PI14/00547 en PI17/02329] en Prof A. Cano [PI12/02582].
Endosampler™ | Medgyn | 22720 | Cannula for sampling the uterine endometrium |
DMEM Medium | VWR | HYCLSH30285.FS | Medium |
Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | Adenoviral vector expressing mCherry |
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4 | VWR | E504-500ML | Buffer for washes |
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days | Innovative Research of America | SE-121 | Hormone pellets for rodents |
Vetbond™ Tissue Adhesive | 3M | 780-680 | Tissue adhesive |
Petri dishes in polystyrene crystal | Levantina | 367-P101VR20 | Petri dishes |
Penicillin-Streptomicin | Sigma | P4333-100ML | Antibiotics |
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml | VWR | CODA626616 | Syringes |
Nitrile gloves, powder-free | VWR | 112-2754 | Gloves |
Soft swiss nude mice | Charles River | SNUSSFE05S | Mice for animal experiment |
Ivis Spectrum In vivo Imaging system | Perkin Elmer | 124262 | In vivo Monitoring equipment |
Living Image® (Ivis software) | Perkin Elmer | — | In vivo monitoring software |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | Enrichment serum |
96-well cell culture treated plates | Life technologies | 167008 | Culture plates |
Urine flasks | Summedical | 4004-248-001 | Flasks for washes |
Sterile surgical blades | (Aesculap Division) Sanycare | 1609022-0008 | Surgical blades |
Isovet 1000 mg/g | B-BRAUN | — | Isoflurane (Anesthetic) |
Buprex® 0.3 mg | Schering Plough S.A. | — | Buprenorphine (Analgesic solution) |
Injectable morphine solution 10 mg/mL | B BRAUN | — | Morphine (Analgesic solution) |
Monofyl® Absorbable Sutures | COVIDIEN | — | Sutures |
Desinclor chlorhexidine | Promedic SA | — | Antiseptic solution |
Microscopy DMi8 | Leica Mycrosystems | — | fluorescence microscope |
Hera Cell 150 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | Incubator |