Noninvasiv overvågning af læsion størrelse i en heterolog musemodel af endometriose

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for live-imaging af fluorescently mærket menneskelige endometrie fragmenter podet i mus. Metoden giver mulighed for at studere virkningerne af narkotika af valg på endometriotic læsion størrelse gennem overvågning og kvantificering af fluorescens udledes af fluorescerende reporter på realtid

Abstract

Her, beskriver vi en protokol for gennemførelsen af en heterolog musemodel, hvor progressionen af endometriose kan vurderes i realtid via noninvasive overvågning af fluorescens udledes af implanterede ektopisk menneskelige endometriosevævet. Til dette formål fås biopsier af menneskelige endometriet fra donor kvinder løbende oocyt donation. Menneskelige endometrie fragmenter er kulturperler i overværelse af adenovirus manipuleret til at udtrykke cDNA for reporter fluorescerende protein mCherry. Efter visualisering, mærket væv med en optimal mængde af fluorescens efter infektion er efterfølgende valgt til implantation i modtagerens mus. En uge før implantering, recipient mus er oophorectomized, og estradiol pellets er placeret subkutant til at opretholde overlevelse og vækst af læsioner. På dagen for operationen er mus bedøvede og peritoneale hulrum adgang via en lille (1,5 cm) indsnit via linea-alba. Fluorescently mærket implantater er tweezed, kort indsmurt i lim og knyttet til laget peritoneal. Snit er syet, og dyr tilbage til at inddrive for et par dage. Fluorescens udledes af endometriotic implantater er normalt ikke-invasivt overvåget hver 3 dag for 4 uger med en in vivo billeddannelse system. Variationer i størrelsen af endometriotic implantater kan estimeres i realtid af kvantificering af mCherry signal og normalisering mod det oprindelige tidspunkt viser maksimal fluorescens intensitet.

Traditionelle prækliniske gnavere modeller af endometriose tillader ikke ikke-invasiv overvågning af læsion i realtid men snarere muliggøre evaluering af virkningerne af narkotika analyseres ved slutpunktet. Denne protokol tillader en at spore læsioner i realtid og er mere nyttigt at udforske den terapeutiske potentiale af narkotika i prækliniske modeller af endometriose. Den største begrænsning af modellen således genereret er non-invasiv overvågning ikke muligt over længere perioder på grund af det episomal udtryk for annonce-virus.

Introduction

Endometriose er en kronisk gynækologisk lidelse initieret af implantation af funktionelle endometrium uden for livmoderhulen. Ektopiske læsioner vokse og inducerer inflammatoriske processer, der fører til kronisk bækken smerter og barnløshed¹. Det anslås, at op til 10-15% af kvinder i den fødedygtige alder er påvirket af endometriosis2, og det er til stede i ca. 40 – 50% af infertile kvinder³. Nuværende farmakologiske behandlinger for endometriose er ude af stand til helt udrydde læsioner og ikke fri for bivirkninger^4,5. Forskning for mere effektive terapier kræver af forfinelse af de eksisterende Dyremodeller for endometriose på en sådan måde, at menneskelige læsioner kan efterlignes korrekt, og virkningerne af forbindelser på læsion størrelse blandt andre kan vurderes nøje.

Primat modeller har været brugt til at efterligne endometriose ved at implantere ektopisk læsioner til histologisk identiske og på lignende steder som mennesker^6,7,8; Men, etiske overvejelser og de høje økonomiske omkostninger relateret til forsøg med primater grænse deres brug⁹. Brugen af små dyr, især gnavere, til gennemførelsen af in vivo modeller af endometriose fortsat blive begunstiget, da det giver mulighed for undersøgelser med et større antal individer^10,11. Endometriose kan være fremkaldt hos disse dyr ved hjælp af transplantation enten stykker af gnaver uterin horn (“homologe modeller”)^12,13 eller menneskelige endometrie/endometriotic væv til ektopiske steder (heterolog modeller)¹⁴ . I modsætning til mennesker, gnavere kaste ikke deres endometriosevævet og dermed endometriose kan ikke udvikles spontant i disse arter. Homologe mus modeller af endometriose er blevet kritiseret, at implanteret ektopisk mus uterin væv afspejler derfor ikke Karakteristik af menneskelige endometriotic læsioner¹⁵.

Passende fysiologi af endometriose kan efterlignes i heterolog modeller af endometriose hvor frisk menneskelige endometrie fragmenter er implanteret i immundefekte dyr. I konventionelle heterolog modeller vurderes de terapeutiske virkninger af forbindelser af interesse almindeligvis ved slutpunktet ved vurdering af læsion størrelse med brug af calipre¹⁶. En indlysende begrænsning er, at som sådan slutpunkt dyremodeller ikke studerer implantation dynamics eller endometriotic læsion udvikling over tid. En yderligere begrænsning er, at brugen af calipre ikke tillader nøjagtige målinger af læsion størrelse. Faktisk, standard fejlmargen af calipre er i den samme række (f.eks. millimeter) som størrelsen af de læsioner, som implanteres i mus, dermed begrænser evne af disse værktøjer til at registrere faktiske variationer i størrelse.

For at overvinde sådanne begrænsninger, heri, beskriver vi generation af en heterolog musemodel af endometriose, hvor indopereret humant væv er manipuleret til at udtrykke en reporter m-Cherry fluorescerende proteiner. Påvisning af de fluorescerende signal med et passende billede system gør det muligt for ikke-invasiv overvågning af læsion status med samtidige kvantificering af sin størrelse i realtid. Således giver vores model klare fordele i forhold til konventionelle slutpunkt modeller, da det giver mulighed for real-time non-invasiv overvågning og muligheden for at udføre mere objektive og nøjagtig vurdering af variationer i læsion størrelse.

Protocol

Brugen af menneskelige væv prøver blev godkendt af institutionelle Review Board og etiske komité i den Hospital Universitario La Fe. Alle patienter givet skriftlig informeret samtykke. Den undersøgelse, der involverer dyr blev godkendt af det institutionelle Animal Care udvalg på Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, og alle procedurer blev udført efter retningslinjer for pleje og brug af pattedyr fra de nationale kontorer af sundhed. 1. endometriosevævet indsamling og forb…

Representative Results

Her, beskriver vi processen til oprettelse af en heterolog model af endometriose hvor arkitektur af læsioner er bevaret ved at implantere fluorescently mærket stykker af menneskelige endometriet til immunkompromitterede mus, således at ikke-invasive overvågning af læsion progression. Mærkning af endometrie fragmenter opnås ved infektion med adenovirus manipuleret til at udtrykke mCherry, et protein, der udsender fluorescens i nær infrarøde område. I figur 1<…

Discussion

Protokollen heri detaljeret beskriver gennemførelsen af en dyremodel af endometriose, hvor arkitektur af implanterer læsioner arkitektur er bevaret mens samtidig giver mulighed for tidstro vurdering af fluorescens udledes af mCherry mærket endometriosevævet. I denne protokol beskriver vi brugen af en bestemt in vivo billedbehandlingssystem og tilhørende software til ikke-invasivt vurdere fluorescens udledes af mærket læsion. Hver bruger skal tilpasse protokollen afhængigt af specifikke imaging enhed og tilhørend…

Materials

Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	—	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1000 mg/g	B-BRAUN	—	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	—	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	—	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	—	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	—	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	—	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator