Monitorização não invasiva do tamanho da lesão em um modelo de Mouse heteróloga de endometriose

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ao vivo de fluorescente etiquetadas fragmentos endometriais humanas transplantada em ratos. O método permite estudar os efeitos das drogas de escolha no tamanho da lesão endometriotic através do acompanhamento e quantificação da fluorescência emitida pelo repórter fluorescente em tempo real

Abstract

Aqui, descrevemos um protocolo para a implementação de um modelo de mouse heteróloga em que a progressão da endometriose pode ser avaliada em tempo real através de monitorização não-invasiva da fluorescência emitida pelo implante ectópico humano tecido endometrial. Para essa finalidade, biópsias do endométrio humano são obtidas a partir de doação de oócito em curso de mulheres de doador. Fragmentos de endométrio humanos são cultivados na presença de adenovírus projetados para cDNA expresso para o repórter mCherry de proteína fluorescente. Após a visualização, rotulado tecidos com uma taxa ideal de fluorescência após infecção posteriormente são escolhidos para a implantação em ratos do destinatários. Uma semana antes da cirurgia de implante, destinatários ratos são oophorectomized, e pelotas de estradiol são colocadas por via subcutânea para sustentar a sobrevivência e o crescimento das lesões. No dia da cirurgia, os ratos são cavidade peritoneal e anestesiada, acessada através de uma incisão de pequeno (1,5 cm) pelo linea-alba. Implantes fluorescente etiquetados são depilar, brevemente embebidos em cola e anexados à camada peritoneal. As incisões são suturadas e animais deixaram de recuperar por um par de dias. Fluorescência emitida por implantes endometriotic geralmente não invasiva é monitorada a cada 3 dias por 4 semanas com um sistema de imagens in vivo. Variações no tamanho dos implantes endometriotic podem ser estimadas em tempo real pela quantificação do sinal de mCherry e normalização contra o tempo-ponto inicial mostrando a intensidade da fluorescência máxima.

Roedores pré-clínicos tradicionais de modelos de endometriose não permitem monitoramento invasivo da lesão em tempo real, mas bastante permitam a avaliação dos efeitos das drogas na analisada no ponto final. Este protocolo permite rastrear lesões em tempo real e é mais útil para explorar o potencial terapêutico de drogas em modelos pré-clínicos de endometriose. A principal limitação do modelo gerado, portanto, é que o monitoramento não-invasivo não é possível durante longos períodos de tempo devido a expressão epissomal Ad-vírus.

Introduction

Endometriose é uma doença ginecológica crônica iniciada pela implantação do endométrio funcional fora da cavidade uterina. Gravidez ectópica lesões crescem e induzem processos inflamatórios, levando a crônica pélvica dor e infertilidade¹. Estima-se que acima de 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva são afetadas por endometriosis2, e está presente em aproximadamente 40-50% das mulheres inférteis³. Os tratamentos farmacológicos atuais para endometriose são incapazes de erradicar completamente as lesões e não é livre de efeitos colaterais^4,5. A pesquisa das terapias mais eficientes requer de refinamento de modelos animais existentes da endometriose, de tal forma que lesões humanas podem ser imitadas adequadamente, e os efeitos dos compostos no tamanho da lesão entre outros podem ser avaliados de perto.

Modelos de primatas têm sido utilizados para imitar a endometriose por responsável ectópica lesões histologicamente idênticas e em sites semelhantes como seres humanos^6,7,8; no entanto, as preocupações éticas e os elevados custos económicos relacionam à experimentação com primatas limite seu uso⁹. Consequentemente, a utilização de pequenos animais, especialmente roedores, para a implementação de modelos in vivo de endometriose continua a ser favorecida, pois permite estudos com maior número de indivíduos de^10,11. Endometriose pode ser induzida nestes animais transplantando ou pedaços de roedores cornos uterinos (“modelos homólogos”)^12,13 ou tecido endometrial/endometriotic humano para sites de gravidez ectópica (modelos heterólogos)¹⁴ . Em contraste com os humanos, roedores não derramem seu tecido endometrial e, assim, endometriose não pode ser desenvolvida espontaneamente nestas espécies. Portanto, homólogo rato modelos da endometriose tem sido criticados, devido ao fato de que implantou o tecido uterino de gravidez ectópica do mouse não reflete as características de lesões endometriotic humana¹⁵.

Fisiologia adequada da endometriose pode ser imitada nos modelos heterólogos de endometriose, onde fragmentos de endométrio humanos frescos são implantados em animais imunodeficientes. Em modelos convencionais heterólogos, os efeitos terapêuticos de compostos de interesse são comumente avaliados no ponto final pela avaliação do tamanho da lesão com o uso de compassos de calibre¹⁶. Uma limitação óbvia é que, como tal, modelos animais de ponto de extremidade não permitem estudar a dinâmica de implantação ou desenvolvimento de lesão endometriotic ao longo do tempo. Uma limitação adicional é que o uso de compassos de calibre não permite medições precisas de tamanho da lesão. Na verdade, o erro-padrão fornecido por pinças é na mesma faixa (ou seja, milímetros) como o tamanho das lesões implantado em ratos, restringindo assim a capacidade dessas ferramentas para detectar variações reais em tamanho.

Neste documento, a fim de superar tais limitações, descrevemos a geração de um modelo de mouse heteróloga da endometriose, em que é engenharia de tecidos humanos implantado para expressar uma proteína fluorescente m-cereja de repórter. Deteção do sinal fluorescente com um sistema de imagem apropriado permite monitoramento invasivo do status de lesão com quantificação simultânea de seu tamanho em tempo real. Assim, nosso modelo fornece vantagens evidentes quando comparado aos modelos convencionais de ponto de extremidade, pois traz a oportunidade de monitoramento não-invasivo em tempo real e a possibilidade de realizar mais objectivo e estimativa exacta das variações no tamanho da lesão.

Protocol

O uso de amostras de tecido humano foi aprovado pelo Comitê de ética do Hospital Universitario La Fe e Conselho de revisão institucional. Todos os pacientes fornecidos escrito consentimento informado. O estudo envolvendo animais foi aprovado pelo Comitê de cuidados institucionais Animal no Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, e todos os procedimentos foram realizados seguindo as orientações para o cuidado e o uso de mamíferos de institutos nacionais de de saúde. 1. pré-p…

Representative Results

Aqui, descrevemos o processo para criar um modelo heterólogo da endometriose, em que a arquitetura das lesões é preservada pela implantação fluorescente etiquetados pedaços de endométrio humano em ratos imunodeprimidos, permitindo que não-invasiva monitoramento da progressão da lesão. Rotulagem de fragmentos endometriais é alcançado por infecção com adenovírus projetado para mCherry express, uma proteína que emitem fluorescência na região do infravermelho próxima. Na <s…

Discussion

O protocolo detalhado neste documento descreve a implementação de um modelo animal de endometriose, em que a arquitetura de implantação de arquitetura de lesões é preservada enquanto simultaneamente, permitir avaliação em tempo real da fluorescência emitida pelo mCherry rotulado de tecido endometrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um sistema de imagens in vivo específico e software relacionado de forma não-invasiva avaliar fluorescência emitida pela lesão rotulada. Cada usuário deve adaptar…

Materials

Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	—	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1000 mg/g	B-BRAUN	—	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	—	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	—	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	—	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	—	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	—	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator