Monitoreo no invasivo del tamaño de la lesión en un modelo de ratón heterólogos de la Endometriosis

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes en vivo de fluorescencia etiquetadas fragmentos de endometrio humanos injertado en ratones. El método permite estudiar los efectos de los fármacos de elección en el tamaño de la lesión endometriotic a través del monitoreo y cuantificación de la fluorescencia emitida por el reportero fluorescente en tiempo real

Abstract

Aquí, describimos un protocolo para la implementación de un modelo de ratón heteróloga en la que la progresión de la endometriosis puede evaluarse en tiempo real a través de monitoreo no invasivo de la fluorescencia emitida por tejido endometrial humano ectópico implantado. Para ello, se obtienen biopsias de endometrio humano de donación de ovocitos curso de mujeres donantes. Fragmentos de endometrio humanos son cultivadas en presencia de adenovirus diseñados para expresar cDNA para el reportero proteína fluorescente mCherry. Sobre visualización, etiquetados como los tejidos con una tasa óptima de fluorescencia después de infección son posteriormente seleccionados para la implantación en ratones receptores. Una semana antes de la cirugía de implantación, ratones receptores son ooforectomizadas, y pastillas de estradiol se colocan subcutáneamente para mantener la supervivencia y el crecimiento de las lesiones. En el día de la cirugía los ratones son anestesia y peritoneal cavidad accedida a través de una incisión pequeña (1,5 cm) por la linea-alba. Fluorescencia de etiquetado implantes son tweezed, brevemente empapados en pegamento y Unidos a la capa peritoneal. Incisiones se suturan, y animales a la izquierda para recuperar un par de días. Fluorescencia emitida por implantes endometriotic generalmente no invasiva se controla cada 3 días durante 4 semanas con un sistema de proyección de imagen in vivo. Variaciones en el tamaño de los implantes endometriósicos se pueden estimar en tiempo real por la cuantificación de la señal mCherry y normalización contra el momento inicial que muestra la intensidad de la fluorescencia máxima.

Tradicionales roedores preclínicas de los modelos de la endometriosis no permiten monitoreo no invasivo de la lesión en tiempo real pero que permiten la evaluación de los efectos de las drogas analizadas en el punto final. Este protocolo permite un seguimiento de las lesiones en tiempo real y es más útil para explorar el potencial terapéutico de los fármacos en modelos preclínicos de la endometriosis. La principal limitación del modelo así generado es que el monitoreo no invasivo no es posible durante largos períodos de tiempo debido a la expresión episomal del Ad virus.

Introduction

La endometriosis es un trastorno ginecológico crónico por la implantación del endometrio funcional fuera de la cavidad uterina. Lesiones ectópicas crecen y provocar procesos inflamatorios conduce a crónico pélvico dolor e infertilidad¹. Se estima que hasta a 10 – 15% de las mujeres en edad reproductiva sufren de endometriosis2, y está presente en aproximadamente el 40-50% de las mujeres estériles³. Los tratamientos farmacológicos para la endometriosis son incapaces de erradicar completamente las lesiones y no están libres de efectos secundarios^4,5. La investigación de terapias más eficientes requiere del refinamiento de los modelos existentes de animal de endometriosis de tal manera que las lesiones humanas pueden mímico apropiadamente y evaluar de cerca los efectos de compuestos en el tamaño de la lesión entre otros.

Modelos de primates se han utilizado para imitar la endometriosis implantación ectópicas lesiones histológicamente idénticas y en sitios similares como en los seres humanos^6,7,8; sin embargo, preocupaciones éticas y los altos costos económicos relacionados con la experimentación con primates límite su uso⁹. En consecuencia, el uso de pequeños animales, especialmente roedores, para la implementación de modelos in vivo de la endometriosis sigue ser favorecido ya que estudios con un mayor número de individuos^10,11. La endometriosis puede ser inducida en estos animales mediante el trasplante de pedazos de cuernos uterinos roedores “(modelos de homólogos”)^12,13 o tejido endometrial/endometriotic humano a sitios ectópicos (modelos heterólogos)¹⁴ . A diferencia de los seres humanos, roedores no arrojar su tejido endometrial y así endometriosis puede no desarrollarse espontáneamente en estas especies. Por lo tanto, ratón homólogo modelos de la endometriosis han sido criticados debido a que implanta tejido uterino ratón ectópico no refleja las características de las lesiones endometriotic humana¹⁵.

Fisiología adecuado de la endometriosis se puede mímico en los modelos heterólogos de la endometriosis donde fragmentos de endometrio humanos frescos implantados en animales inmunodeficientes. En modelos convencionales heterólogos, los efectos terapéuticos de compuestos de interés se evalúan comúnmente en el punto final de la evaluación del tamaño de la lesión con el uso de pinzas¹⁶. Una limitación obvia es que, como tal, modelos animales extremo no permiten estudiar la dinámica de implantación o desarrollo de la lesión endometriotic con el tiempo. Una limitación adicional es que el uso de calibradores no permite mediciones precisas del tamaño de la lesión. De hecho, el error estándar proporcionado por pinzas es en el mismo rango (es decir, milímetros) como el tamaño de las lesiones en ratones, así limitar la capacidad de estas herramientas para detectar las variaciones reales en el tamaño.

Para superar tales limitaciones, adjunto, describimos a la generación de un modelo de ratón heterólogos de la endometriosis en la cual implantado tejido humano está diseñado para expresar una proteína fluorescente reportera m-Cherry. Detección de la señal fluorescente con un sistema apropiado de la imagen permite la monitorización no invasiva del estado de la lesión con cuantificación simultánea de su tamaño en tiempo real. Por lo tanto, nuestro modelo ofrece claras ventajas en comparación con los modelos convencionales de punto final que trae la oportunidad de en tiempo real monitoreo no invasivo y la posibilidad de hacer más objetiva y exacta estimación de las variaciones en el tamaño de la lesión.

Protocol

El uso de muestras de tejido humano fue aprobado por la Junta de revisión institucional y Comité de ética del Hospital Universitario La Fe. Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El estudio con animales fue aprobado por el Comité institucional de cuidado de animales en el Centro de Investigación Príncipe Felipe de Valencia, y todos los procedimientos fueron realizados siguiendo los lineamientos para el cuidado y uso de los mamíferos de los institutos nacionales de de la salud….

Representative Results

Aquí, describimos el proceso para la creación de un modelo heterólogo de la endometriosis en la cual se conserva la arquitectura de las lesiones implantando fluorescencia etiquetadas pedazos de endometrio humano en ratones inmunocomprometidos, permitiendo de este modo no invasivo seguimiento de la progresión de la lesión. Etiquetado fragmentos endometriales se logra por la infección con adenovirus dirigido a expreso mCherry, una proteína que emite fluorescencia en la región infrar…

Discussion

El protocolo detallado en el presente documento describe la aplicación de un modelo animal de endometriosis en la cual la arquitectura de implantación de arquitectura de lesiones se conserva mientras que simultaneamente permite evaluación en tiempo real de la fluorescencia emitida por mCherry etiquetado el tejido endometrial. En este protocolo, describimos el uso de un sistema específico de proyección de imagen en vivo y programas relacionados con evaluación no invasiva fluorescencia emitida por la lesión marcada….

Materials

Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	—	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1000 mg/g	B-BRAUN	—	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	—	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	—	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	—	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	—	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	—	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator