Icke-invasiv övervakning av Mållesionens storlek i ett heterologt musmodell för endometrios

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för live-imaging av fluorescently märkt mänskliga livmodercancer fragment ympas in möss. Metoden gör det möjligt att studera effekterna av droger val på endometriotic lesionsstorlek genom övervakning och kvantifiering av fluorescens som avges av fluorescerande reportern på realtid

Abstract

Här beskriver vi ett protokoll för genomförandet av ett heterologt musmodell där progression av endometrios kan bedömas i realtid genom icke-invasiv övervakning av fluorescens som avges av implanterade ektopisk mänsklig livmodercancer vävnad. För detta ändamål erhålls biopsier av mänskliga endometriet från givare kvinnor pågående äggcellen donation. Mänskliga livmodercancer fragment är odlade i närvaro av adenoviruses konstruerad att uttryckliga cDNA för den reporter fluorescerande protein mCherry. Vid visualisering, märkt vävnader med en optimal frekvens av fluorescens efter infektion väljs därefter för implantation i mottagarens möss. En vecka före implantation kirurgi, mottagarens möss är oophorectomized och estradiol pellets placeras subkutant för att upprätthålla överlevnad och tillväxt av lesioner. På operationsdagen är möss sövda och peritoneal hålighet nås genom en liten (1,5 cm) snitt av linea-alba. Fluorescently märkta implantat är tweezed, kortfattat indränkt i lim och bifogas peritoneal lagret. Snitt är sys, och djur kvar för att återvinna för ett par dagar. Fluorescens som avges av endometriotic implantat är oftast icke-invasivt övervakas varje 3 dagar i 4 veckor med ett in vivo imaging system. Variationer i storlek av endometriotic implantat kan beräknas i realtid genom kvantifiering av mCherry signal och normalisering mot den första tidpunkt visar maximal fluorescensintensiteten.

Traditionella prekliniska gnagare modeller av endometrios tillåter inte icke-invasiv övervakning av lesion i realtid men snarare möjliggöra utvärdering av effekterna av narkotika analyseras vid slutpunkten. Detta protokoll gör att man kan spåra lesioner i realtid och är mer användbar för att undersöka den terapeutiska potentialen av droger i prekliniska modeller av endometrios. Den största begränsningen av frigjorda-modellen är att icke-invasiv övervakning inte är möjligt under en längre tid på grund av ett episomal uttryck för Ad-virus.

Introduction

Endometrios är en kronisk gynekologisk sjukdom som initierats av implantation av funktionella livmoderslemhinnan utanför livmoderhålan. Ektopisk lesioner växer och inducerar inflammatoriska processer som leder till kronisk bäcken smärta och infertilitet¹. Det uppskattas att upp till 10 – 15% av kvinnor i fertil ålder är drabbade av endometriosis2, och det är närvarande i cirka 40 – 50% av infertila kvinnor³. Aktuella farmakologiska behandlingar för endometrios är inte att helt utrota lesioner och inte fria från biverkningar^4,5. Forskning för effektivare terapier kräver av förfiningen av de befintliga djurmodeller av endometrios på ett sådant sätt att människors lesioner kan vara lämpligt härmade och effekterna av föreningar på lesionsstorlek bland annat kan bedömas noggrant.

Primate modeller har använts för att efterlikna endometrios genom att implantera ektopisk lesioner histologiskt identiska och på liknande platser som människor^6,7,8. dock relaterade etiska betänkligheter och de höga ekonomiska kostnaderna till experiment med primater gräns deras användning⁹. Följaktligen, användning av små djur, speciellt gnagare, för genomförandet av in vivo-modeller av endometrios fortsätter att vara gynnad eftersom det tillåter studier med större antal individer^10,11. Endometrios kan induceras hos dessa djur av omplantering antingen bitar av gnagare livmoderns horn (”homologa modeller”)^12,13 eller mänsklig endometriehyperplasi/endometriotic vävnad till ektopisk webbplatser (heterologa modeller)¹⁴ . I motsats till människor, gnagare utgjuta inte deras livmodercancer vävnad och därmed endometrios kan inte utvecklas spontant i dessa arter. Homologa mus modeller av endometrios har kritiserats på grund av att implanteras ektopisk mus uterin vävnad avspeglar därför inte kännetecknen av mänskliga endometriotic lesioner¹⁵.

Lämpliga fysiologi endometrios kan vara härmade i heterologa modeller av endometrios där färska mänskliga livmodercancer fragment implanteras i nedsatt immunförsvar djur. I konventionella heterologa modeller bedöms de terapeutiska effekterna av föreningar av intresse vanligen vid slutpunkten av bedömningen av mållesionens storlek med hjälp av bromsok¹⁶. En uppenbar begränsning är att, som sådan, endpoint djurmodeller inte tillåter studerar implantation dynamics eller endometriotic lesion utveckling över tid. En ytterligare begränsning är att användningen av bromsok inte tillåter noggranna mätningar av mållesionens storlek. Standardfel som tillhandahålls av bromsok är faktiskt i samma intervall (dvs millimeter) i samma storlek som de lesioner som implanteras i möss, vilket begränsar kapaciteten av dessa verktyg att upptäcka faktiska variationer i storlek.

För att övervinna sådana begränsningar, beskriver vi häri, generering av ett heterologt musmodell av endometrios där implanterade mänsklig vävnad är konstruerad för att uttrycka en reporter m-Cherry fluorescerande protein. Påvisande av fluorescerande signalen med en lämplig bild system möjliggör icke-invasiv övervakning av lesion status med samtidiga kvantifiering av dess storlek i realtid. Vår modell ger således tydliga fördelar jämfört med konventionella endpoint modeller eftersom det ger möjlighet för icke-invasiv övervakning i realtid och möjligheten att utföra mer objektiva och korrekt uppskattning av variationer i lesionsstorlek.

Protocol

Användning av mänsklig vävnad exemplar godkändes av den institutionella Review Board och etikkommittén Hospital Universitario La FE. Alla patienter som skriftligt informerat samtycke. Studien som involverar djur godkändes av utskottet institutionella djur vård vid Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, och alla procedurer utfördes efter riktlinjerna för skötsel och användning av däggdjur från de nationella instituten av hälsa. 1. livmodercancer vävnad insamling och f…

Representative Results

Här, beskriver vi processen för att skapa ett heterologt modell av endometrios där arkitekturen av lesioner bevaras genom att implantera fluorescently märkt bitar av mänskliga endometriet till immunsupprimerade möss, vilket möjliggör icke-invasiv övervakning av lesion progression. Märkning av livmodercancer fragment uppnås genom infektion med adenovirus konstruerad att uttryckliga mCherry, ett protein som avger fluorescens i nära infraröda området. I fig…

Discussion

Protokollet beskrivs häri beskriver genomförandet av en djurmodell av endometrios där arkitekturen att implantera lesioner arkitekturen är bevarad medan samtidigt tillåter realtid bedömning av fluorescens som avges av mCherry märkt livmodercancer vävnad. I detta protokoll beskriver vi användning av en specifik i vivo imaging system och tillhörande programvara att bedöma icke-invasivt fluorescens som avges av märkt lesionen. Varje användare bör anpassa protokollet beroende på specifika bildenhet och relater…

Materials

Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 ml 0,5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	—	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1000 mg/g	B-BRAUN	—	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	—	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	—	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	—	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	—	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	—	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator