Analyse de la dynamique de l'actomyosine à l'échelle locale cellulaire et tissulaire à l'aide de films time-lapse de chambres d'oeufs drosophila cultivées

Summary

Ce protocole fournit une méthodologie basée sur les Fidji, conviviale avec des instructions simples expliquant comment analyser de façon fiable le comportement de l'actomyosine dans les cellules individuelles et les tissus épithéliales courbés. Aucune compétence en programmation n'est requise pour suivre le tutoriel; toutes les étapes sont effectuées de manière semi-interactive à l'aide de l'interface utilisateur graphique de Fidji et des plugins associés.

Abstract

Les œufs immatures de Drosophila sont appelés chambres d'oeufs, et leur structure ressemble aux organes primitifs qui subissent des changements morphologiques d'un rond à une forme ellipsoïde pendant le développement. Ce processus de développement est appelé oogenesis et est crucial pour générer des œufs matures fonctionnels pour sécuriser la prochaine génération de mouches. Pour ces raisons, les chambres à œufs ont servi de modèle idéal et pertinent pour comprendre le développement des organes animaux.

Plusieurs protocoles de culture in vitro ont été développés, mais il y a plusieurs inconvénients à ces protocoles. L'une consiste à appliquer diverses couvertures qui exercent une pression artificielle sur les chambres d'œufs imageafin de les immobiliser et d'augmenter le plan d'acquisition imagede de la surface circonférence des chambres d'oeufs analysées. Une telle approche peut influencer négativement le comportement de la machinerie actomyosine mince qui génère la puissance de faire pivoter les chambres d'oeufs autour de leur axe plus long.

Ainsi, pour surmonter cette limitation, nous culture Drosophila chambres d'oeufs librement dans les médias afin d'analyser de façon fiable machines actomyosin le long de la circonférence des chambres d'oeufs. Dans la première partie du protocole, nous fournissons un manuel détaillant comment analyser la machinerie d'actomyosine dans un plan d'acquisition limité à l'échelle cellulaire locale (jusqu'à 15 cellules). Dans la deuxième partie du protocole, nous fournissons aux utilisateurs un nouveau plugin basé à Fidji qui permet l'extraction simple d'une mince couche définie de la surface circonférence des chambres d'oeufs. Le protocole suivant décrit ensuite comment analyser les signaux d'actomyosine à l'échelle des tissus (cellules de 50). Enfin, nous repérons les limites de ces approches à la fois à l'échelle cellulaire et tissulaire locale et discutons de son développement futur potentiel et des applications possibles.

Introduction

Le développement continu de nouvelles technologies d'imagerie et de logiciels avec des applications dans les sciences de la vie a eu un impact énorme sur la compréhension des principes de base de la vie. L'un des principaux défis est la visualisation fiable des processus de développement en combinaison avec leur imagerie en direct dans divers tissus. Les tissus font partie des organes et des corps et, en tant que tels, la majorité d'entre eux ne sont pas facilement accessibles pour l'imagerie. Par conséquent, des protocoles qui permettent leur dissection et la culture in vitro ont été développés afin de visualiser des événements biologiques qui reflètent suffisamment la situation in vivo au sein d'un corps vivant.

Au cours des dernières décennies, la culture et l'imagerie vivante des chambres d'œufs Drosophila, des structures semblables à des acinars ressemblant à des organes primitifs, ont énormément contribué à la compréhension des principes de base du développement des organes primitifs^{1 , 2 (en) , 3}. Actuellement, il existe plusieurs protocoles de culture, et leur utilisation dépend du temps d'acquisition, du type de cellule à imager et de leur accessibilité (p. ex., lignée germinale interne par rapport à la ligne somatique extérieure)⁴.

Une caractéristique commune dans tous ces protocoles de culture est la nécessité de l'immobilisation des chambres d'oeufs analysées qui montrent une activité contractile élevée dans les médias liquides. L'activité contractile des chambres d'oeufs est causée principalement par la feuille de muscle qui couvre une longue chaîne de chambres d'oeufs connectés^5,6,7. Par conséquent, pour parvenir à l'immobilisation appropriée des chambres d'oeufs jeunes, diverses approches ont été développées, impliquant la couverture des chambres d'oeufs avec des couvertures^6,8,9 ou des couvertures flexibles^{4, 10} ou les intégrer dans l'agarose à faible point de fusion^3,11. Ces approches sont populaires car elles permettent également l'imagerie d'un plan visuel plus grand en raison de l'aplatissement subtil de la surface circonférence des chambres d'oeufs.

Cependant, récemment, il a été démontré que les jeunes chambres d'oeufs (stade 1-8) tournent autour de leur axe antérieur-postérieur⁶ et que ce mouvement de tissu est actionné par un réseau fin d'actomyosine près de la surface circonférence de ces jeunes chambres ^{d'oeufs 12}. Par conséquent, l'altération artificielle de la surface cellulaire provoquée par un aplatissement subtil de ce tissu peut avoir un impact négatif sur le comportement de la machinerie d'actomyosine génératrice de force. Le contrepoint est que si le tissu de la chambre d'oeuf s'est aplati, l'imagerie microscopique des protéines à la surface circonférence des chambres d'oeufs devient encore plus limitée par la taille diminuée du plan d'acquisition.

Par conséquent, nous avons combiné des protocoles de Prasad et coll.⁹ et du laboratoire de Celeste Berg^4,10 et nous les avons modifiés de façon à ce qu'aucune couverture/couverture flexible/agarose ne soit utilisée dans la méthode développée. Les chambres d'oeufs drosophiles sont librement cultivées dans les médias et le protocole présenté ici ne s'applique qu'à la microscopie inversée. Il y a deux parties au protocole. La première partie est axée sur l'analyse des signaux d'actomyosine à l'échelle cellulaire locale (jusqu'à 15 cellules) dans les chambres d'oeufs. Dans la deuxième partie, nous nous concentrons sur le dépassement des limites associées à un petit plan d'acquisition causé par la culture libre des chambres d'oeufs. À cet égard, nous avons développé une nouvelle méthode de calcul basée sur Fidji avec une interface utilisateur graphique semi-interactive qui extrait sélectivement et déploie des couches définies d'une surface tissulaire circonférence. Ceci est suivi d'un protocole qui décrit comment analyser l'actomyosine à l'échelle tissulaire (c.-à-d., les cellules de 50). Comme l'extraction sélective d'une fine couche définie de tissus épithélials incurvés n'a pas été facilement possible à l'aide d'une projection classique de z-stack (Figure 1), cette méthode facile à utiliser sert de condition préalable importante pour comprendre comportement d'un mince réseau d'actomyosine à l'échelle tissulaire dans les chambres d'oeufs de Drosophila.

En outre, pour faciliter le protocole, nous fournissons des exemples de films en time-lapse (TLMs) et des fichiers d'exemples de comportement myosin II non musclé fluorescent (voir Dossier supplémentaire 3). Myosin II est une protéine motrice et représente la partie contractile active de la machinerie actomyosine. Afin d'imageMyosin II, nous utilisons des lignes transgéniques Drosophila qui contiennent une chaîne de lumière réglementaire modifiée de Myosin II appelé MRLC::GFP (voir tableau des matériaux pour plus de détails)^12,13. Afin de visualiser les membranes cellulaires, le protocole est basé sur des colorants commerciaux (voir Tableau des matériaux). Ce protocole convient non seulement à l'analyse de petits signaux subcellulaires MRLC::GFP^12, mais aussi pour toutes les particules subcellulaires de taille similaire autour de 300 m, telles que celles observées avec Life-Act::GFP^12,14.

Bien que ces deux protocoles soient présentés à l'aide de chambres d'œufs drosophila de culture in vitro, l'acquisition de signaux d'actomyosine peut également être effectuée à l'aide d'autres tissus lors de l'optimisation des supports de culture et en fonction de la disponibilité des protéines étiquetées fluorescentes avec des colorants commerciaux correspondants ou, par exemple, des microinjections d'ARNm pour obtenir des profils transitoires d'expression génique. De même, le protocole basé aux Fidji pour l'extraction d'une couche mince à partir d'une surface circonférence peut être appliqué plus généralement sur les tissus ellipsoïdes et organiques.

Protocol

REMARQUE: Le protocole suivant fournit des instructions sur la façon d'analyser l'actomyosine à l'échelle cellulaire locale et l'échelle tissulaire dans les chambres d'oeufs Drosophila. L'approche à l'échelle locale permet aux utilisateurs d'analyser le comportement détaillé de l'actomyosine dans jusqu'à 15 cellules par chambre d'oeufs et nécessite l'acquisition de TLMs pour une courte période de temps (5-10 min) en utilisant l'imagerie à haute vitesse et un microscope confocal inversé. En revanche, l'échelle tissulaire fournit aux utilisateurs des informations sur l'actomyosine dans 50 à 100 cellules et nécessite l'acquisition de TLM pendant une longue période de temps (30 min) en utilisant l'imagerie à basse vitesse et un microscope à disque filature inversée (voir la figure 2 et paramètres recommandés à chaque échelle du tableau 1). La décision à quelle échelle d'analyser les signaux d'actomyosine dépend entièrement de la question scientifique de l'utilisateur. Les TLM de test accompagnés devraient aider à prendre cette décision.

1. Échelle cellulaire locale (LCS)

REMARQUE: Pour disséquer et imager les chambres d'oeufs drosophila de culture in vitro, suivez le protocole décrit dans le fichier supplémentaire 1. Pour analyser les TLM acquis, continuez avec le protocole suivant. Des liens vers les dossiers de test d'accompagnement des MTL sont fournis dans le fichier supplémentaire 3.

1. Traitement des données des TLM à l'échelle cellulaire locale (LCS)
   1. Correction de l'eau de Javel des TLM pour compenser la dégradation de l'intensité des étiquettes fluorescentes
      1. Assurez-vous qu'une application Fidji à jour est installée sur l'ordinateur utilisé en suivant ces instructions: Fidji -gt; Ouvrir un TLM (par exemple, TestMovie1.tif à partir du fichier supplémentaire 3).
      2. Divisez les canaux de couleur en cliquant sur L'image 'gt; Couleur 'gt; Split Channels.
      3. Effectuer une correction de l'eau de Javel sur les deux canaux en utilisant l'image 'gt; Ajuster 'gt; Bleach Correction 'gt; Simple Ratio 'gt; Intensité de fond 0.0.
         REMARQUE: Si des résultats insatisfaisants sont obtenus, explorez les méthodes de correction dans ce plugin qui s'adaptent le mieux (par exemple, utilisez Histogram Matching au lieu d'un RatioSimple).
   2. Segmentation cellulaire pour générer un masque cellulaire pour les TLM
      1. Si Fidji n'est pas déjà ouvert, le rouvrir (et assurez-vous qu'il est à jour) suite à l'aide 'gt; Mise à jour 'gt; Appliquer les changements 'gt; OK.
      2. Si cela n'a pas déjà été fait, téléchargez la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (à partir de http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm). Faites glisser et laissez tomber ce script aux Fidji.
      3. Ouvrez le fichier TLM .tiff corrigé de l'eau de Javel (voir la section 1.1.1). Divisez les canaux du fichier corrigé de l'eau de Javel à l'aide de l'image et de la couleur.
      4. Exécutez le script téléchargé sur le canal de membrane cellulaire active du TLM sélectionné en appuyant sur l'icône Exécuter dans le script ouvert. Définir le flou Gaussian à 2.500 et la sensibilité de détection cellulaire à -1 et cliquez sur OK. Afin d'obtenir un masque de cellule agréable, ne modifiez pas ces paramètres ci-dessus. Définir la tolérance au bruit estimée entre 10-20 pour les TLM acquis avec l'objectif 63x et cliquez sur OK.
         REMARQUE: Pour d'autres objectifs, différents paramètres peuvent être nécessaires. Plus l'arrière-plan d'un TLM est net, plus la tolérance au bruit estimée est requise.
      5. Un masque cellulaire généré apparaît dans le TLM analysé et aussi dans une nouvelle fenêtre appelée ParticleStack (G), et en outre, une petite fenêtre appelée Action Required apparaît. À partir du masque cellulaire sur le TLM, concentrez-vous uniquement sur les cellules au centre du TLM et sélectionnez celles qui peuvent fournir des contours complets et bien définis tout au long du TLM.
      6. Si les cellules sélectionnées contiennent des contours de cellules artificielles ou supplémentaires, utilisez la fenêtre d'outil de fusion appelée Action Requise dans le TLM. Pour ce dernier, suivez les instructions dans la fenêtre.
         REMARQUE: Assurez-vous que les contours des cellules sont bien définis et correspondent à des membranes cellulaires réelles dans un TLM, car toute imprécision peut avoir un impact sur les analyses ultérieures. D'autres modifications et modifications, telles que l'élimination des cellules indésirables, peuvent être effectuées ultérieurement à l'aide de l'outil de gestionnaire de surface (décrit à la section 1.1.3).
      7. Lorsque les cellules sélectionnées dans le centre correspondent bien aux membranes cellulaires réelles, enregistrer ParticleStack comme un fichier .tiff suivant fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff.
   3. Chargement du masque cellulaire généré dans Surface manager
      1. Installez Surface Manager Plugin¹⁵ dans la configuration Fidji utilisée. Suivez les instructions de Viktorinova et coll.¹⁶.
      2. Open Surface Manager à l'aide de Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D).
         REMARQUE: La fenêtre De gestionnaire Surface affiche plusieurs boutons d'action à droite et une fenêtre vide à gauche. Pour voir tous les boutons d'action, il peut être nécessaire d'étirer la fenêtre dans sa hauteur / largeur. Notez que les délais apparaîtront sous forme de tranches z.
      3. Ouvrez le fichier Correspondant ParticleStack .tiff dans Surface Manager en cliquant sur Fichier 'gt; Ouvrez et sélectionnez l'image pour l'ouvrir (par exemple, ParticlesStack1.tif).
      4. Dans Surface Manager, cliquez sur le bouton Lire le plan d'image et définiz l'index Jacquard à 60 %.
         REMARQUE: Le chargement du fichier ParticlesStack1.tif peut prendre jusqu'à plusieurs minutes, selon la puissance de traitement de l'ordinateur.
      5. Une fois chargée, chaque cellule sera assignée avec un numéro S et apparaîtra dans la partie gauche de la fenêtre de gestionnaire Surface.
         REMARQUE: Pour afficher les contours et les noms de cellules pour toutes les cellules, cochez le Show all et affichez les cases à cocher au bas de la fenêtre de gestionnaire Surface. Il est recommandé d'utiliser cette fonction une fois que les numéros de cellule ont été vérifiés pour leur exactitude.
      6. Cliquez sur le premier numéro S; le contour de la cellule importée de ParticlesStack1.tif apparaît sur le TLM. Vérifiez chaque numéro S importé pour la qualité des contours des cellules dans l'ensemble du TLM et supprimez les cellules indésirables qui affichent des contours cellulaires incorrects. Pour ce faire, mettez en évidence le contour de la cellule et cliquez sur le bouton Supprimer.
         REMARQUE: Il est également possible de corriger les contours imprécis des cellules et d'ajouter de nouveaux contours cellulaires. Ceci est décrit dans la section de discussion.
      7. Enregistrez toutes les cellules corrigées en tant que fichier RoiSet.zip en appuyant sur le bouton Enregistrer sur disque.
         REMARQUE: Si la session doit être interrompue, il est possible de charger le fichier RoiSet dans Surface manager plus tard: ouvrir un TLM à Fidji (Fichier 'gt; Open)et sélectionnez un TLM. Open Surface manager via Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D). Chargez le fichier RoiSet.zip correspondant en cliquant sur la charge à partir du bouton disque et en choisissant le fichier RoiSet.zip approprié. Vérifiez que les masques cellulaires chargés correspondent au TLM chargé.
   4. Correction de la dérive tissulaire dans les TLM
      REMARQUE: Pendant le temps d'acquisition des TLM, des effets de dérive peuvent être observés en raison d'une rotation épithéliale ou d'un mouvement indésirable. Dans les deux cas, nous recommandons de corriger toute dérive afin de simplifier l'analyse manuelle de l'actomyosine plus tard. La correction de dérive n'est requise que pour l'analyse manuelle de l'actomyosine. Ce tutoriel nécessite un logiciel Fidji à jour avec le Plugin MultiStackReg (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) installé.
      1. Ouvrez le TLM corrigé de l'eau de Javel dans les Îles Fidji via Le Fichier et sélectionnez le fichier corrigé de l'eau de Javel créé à l'aide du tutoriel mentionné ci-dessus.
      2. Divisez les canaux et sélectionnez celui qui identifie les membranes cellulaires par l'intermédiaire de l'image et de la couleur et des canaux fractionnés.
      3. Utilisez le protocole suivant lorsque les contours de la cellule ne sont pas visiblement lisses: Processus 'gt; Filtres 'gt; Gaussian Blur. Fixez-le à 1 2 pour un objectif 63x et cliquez sur OK et puis Oui. Cliquez sur Processus 'gt; Binaire 'gt; Convertir en Masque en utilisant les paramètres par défaut; puis, cliquez sur OK.
      4. Chargez le Plugin MultiStackReg suite à Plugins 'gt; Enregistrement 'gt; MultiStackReg.
      5. Assurez-vous que la pile 1 est réglé sur le canal de membrane cellulaire, l'action 1 est réglé pour aligner, et la transformation est réglé à la traduction. Vérifiez la case à cocher Save Transformation File, puis cliquez sur OK.
      6. Rouvrir le TLM sélectionné, le Plugin MultiStackReg, et le fichier de transformation enregistré à l'aide de Fichier 'gt; Ouvrez et sélectionnez un TLM. Fractionner les canaux de couleur en utilisant l'image 'gt; Color 'gt; Split canaux.
      7. Chargez le Plugin MultiStackReg en cliquant sur Plugins 'gt; Enregistrement 'gt; MultiStackReg. Sélectionnez le fichier de transformation de charge en tant qu'action 1.
      8. Laissez la transformation comme corps rigide et cliquez sur OK. Sélectionnez le fichier de transformation précédemment enregistré et cliquez à nouveau sur OK.
      9. Fusionner les canaux d'image et enregistrer le TLM enregistré comme un fichier .tiff suite à l'image 'gt; Couleur 'gt; Canaux de fusion. Enregistrer le fichier en cliquant sur Le Fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff.
         REMARQUE: Il existe d'autres façons de corriger pour une dérive tissulaire dans les Îles Fidji, à savoir via Plugins 'gt; Enregistrement 'gt; StackReg / Correct 3D dérive.
2. Analyse des impulsions d'actomyosine dans Surface manager chez LCS
   REMARQUE: Cette étape du protocole permet aux scientifiques d'identifier si les impulsions d'actomyosine sont présentes dans le tissu analysé et de comprendre le comportement détaillé ainsi que la directionnalité des signaux d'actomyosine.
   1. Ouvrez Fidji et assurez-vous qu'un TLM et son masque cellulaire correspondant sont ouverts dans Surface manager.
      REMARQUE: Assurez-vous que Fidji est installé et à jour et que le Plugin Surface Manager est installé (étape 1.1.3.1).
   2. Ouvrez un TLM avec File 'gt; Ouvrez et sélectionnez un TLM pour ouvrir (par exemple, TestMovie1'bleach.tif). Chargez le gestionnaire de surface Plugin via Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D). Chargez le masque cellulaire enregistré créé dans le tutoriel ici (par exemple, ParticlesStack1.tif) via le fichier 'gt; Ouvrez et sélectionnez un masque cellulaire (par exemple, ParticlesStack1.tif). Chargez la région d'intérêt correspondante (ROI, par exemple, TestMovie1-RoiSet.zip). Voir la figure 3A.
   3. Passez au canal d'intérêt dans le TLM sélectionné.
      REMARQUE: Pour distinguer les canaux, suivez le code couleur indiqué autour du TLM.
   4. Dans Surface Manager, cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir la fenêtre appelée Valeur grise moyenne Tranche par tranche ( Figure3B). Notez que les valeurs d'intensité moyenne/médiane des signaux d'actomyosine dans un canal analysé donné dans les contours définis de la cellule au fil du temps seront affichées, ainsi que d'autres paramètres liés à la zone cellulaire et à la forme des cellules.
      REMARQUE: Les valeurs d'intensité sont dans les unités d'arbitrage (A.U.); la zone cellulaire est en pixels et doit être convertie en micromètres carrés.
   5. Enregistrer les valeurs obtenues en tant que fichier de feuille de calcul. Cliquez sur la fenêtre Statistiques, Fichier 'gt; Enregistrer comme.
      REMARQUE: Il est possible de vérifier les valeurs statistiques obtenues plus tard comme suit : ouvrez le TLM corrigé de l'eau de Javel aux Fidji et ouvrez le gestionnaire de surface. Chargez le RoiSet.zip correspondant au TLM en appuyant sur la charge à partir du bouton disque et ouvrez le fichier. Le masque enregistré avec les contours de cellule sera téléchargé et les noms des cellules apparaîtront dans la fenêtre gauche du gestionnaire Surface. Cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir des valeurs statistiques.
3. Analyse manuelle des signaux d'actomyosine sous-cellulaires individuels à LCS
   REMARQUE: Ce protocole exige le plus de concentration et prend beaucoup de temps. En général, un TLM acquis peut être confortablement analysé dans un délai de 1 jour. Cela n'inclut pas le temps de préparation de la mouche avant leur dissection, la dissection elle-même, et l'acquisition d'image.
   1. Ouvrez un TLM sélectionné, corrigé de l'eau de Javel et enregistré (corrigé de la dérive) dans une application Fidji à jour. Utilisez un TLM corrigé de l'eau de Javel et corrigé par la dérive (p. ex., TestMovie1-bleach-reg.tif) comme exemple d'essai.
   2. Ajuster la luminosité et le contraste pour voir les signaux d'actomyosine individuelle à l'aide de l'image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste.
   3. Aligner les TLM dans la même direction par rapport à l'axe tissulaire/corps. Dans le cas des chambres d'oeufs, alignez le côté antérieur des chambres d'oeuf toujours à gauche de l'image/sousfilm/TLM avant l'analyse.
   4. Divisez le film sélectionné en courts sous-films de 30 s et projetez chacun d'eux. Enregistrez les sous-films non projetés et projetés dans le temps avec les noms correspondants. Gardez la source d'origine.
      REMARQUE: Submovies peut être créé à partir de TLMs d'origine en supprimant d'abord les cadres indésirables via l'image 'gt; Stacks 'gt; Slice Remover. Définir les tranches à enlever et définir Increment. Transformez-le en RGB avant d'utiliser le dissolvant de tranche lorsque l'incrément est no 1. Pour le temps-projet d'un sous-film de 30 s, cliquez sur Image 'gt; Stacks 'gt; Z-projet 'gt; Intensité maximale pour les cadres définis (tranches) et puis cliquez sur OK. Passer chaque seconde 30 s sous-film afin d'éviter de compter les signaux d'actomyosine 2x dans deux sous-films suivants 30 s.
   5. Placez une image projetée dans le temps à côté du sous-film correspondant de 30 s (Figure 4A,B). Identifiez la ligne de signal sur le sous-film projeté dans le temps. Identifiez la direction du mouvement du signal d'actomyosine (0 à 360 degrés) le long de cette ligne dans le sous-film original en jouant manuellement le sous-film. Utilisez l'outil Angle (dans la barre Fidji) pour mesurer manuellement la direction du mouvement du signal par rapport à l'axe tissulaire défini ou à un outil similaire disponible.
      REMARQUE: Fidji ne fonctionne qu'à l'échelle de 0 à 180 degrés (figure4C),et un nouveau calcul des valeurs obtenues sur une échelle de 0 à 360 degrés est nécessaire. Une ligne de signal correspond à la trajectoire d'un mouvement de signal d'actomyosine au fil du temps.
   6. Pour éviter la duplication dans l'analyse des signaux d'actomyosine, marquez les lignes de signal analysées dans les cellules du sous-film projeté dans le temps (figure4B,D).
   7. Analysez toutes les cellules sélectionnées dans le sous-film 30 s et enregistrez les angles obtenus.
      REMARQUE: Analyser seulement les signaux d'actomyosine cytoplasmique subcellulaire dans les cellules avec des contours de cellules bien définis tout au long d'un TLM. Exclure les cellules individuelles avec moins de 15 à 20 signaux détectés dans l'ensemble du TLM. Ignorer les signaux d'actomyosine qui se déplacent à travers les cellules en raison de leur origine inconnue. Un exemple de nombre de signaux pour une cellule analysée dans le sous-film 30 s est affiché dans la figure 4D.
   8. Continuez jusqu'à ce que les 30 sous-films s-long d'un TLM soient analysés, et enregistrez tous les angles mesurés des signaux d'actomyosine d'un TLM dans un fichier de feuille de calcul.
   9. Résumez tous les angles mesurés par rapport au nombre pertinent de TLM (dépendant de l'expérience). Tracer le pourcentage de la direction des signaux analysés d'actomyosine, par exemple, comme un diagramme de rose avec une gamme de 0 à 360 degrés avec un logiciel préféré.
      REMARQUE: Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, cinq à dix chambres d'oeufs indépendantes de n'importe quel stade de chambre d'oeuf sont recommandées pour être analysées.

2. Échelle de tissu

REMARQUE: Pour disséquer et imager les chambres d'oeufs drosophila de culture in vitro, suivez le protocole dans le fichier supplémentaire 2. Pour analyser les TLM acquis, continuez avec le protocole suivant ci-dessous. Les fichiers de test accompagnés des TLM sont placés dans le fichier supplémentaire 3.

1. Extraction sélective de surface des tissus épithélials courbés
   note:Ce protocole permet aux utilisateurs d'extraire sélectivement une fine couche d'actomyosine dans un tissu épithélial incurvé au fil du temps. Cette étape du protocole est conviviale et basée sur une interface graphique intuitive. Il est possible d'analyser confortablement (surface d'extraction) plusieurs TLM. Utilisez TestMovie2.czi (à partir de laDossier supplémentaire 3) comme exemple TLM de test.
   1. Ouvrez une application à jour Fidji (Fidji 'gt; Aide 'gt; Mise à jour 'gt; Appliquer les changements 'gt; OK).
   2. Assurez-vous que le Plugin¹⁵ de projection de surface elliptoïde est installé. Suivre Viktorinova et al. ¹⁶.
   3. Ouvrez un TLM et l'exporter comme un fichier XML / HDF5 en cliquant sur Plugins 'gt; BigDataViewer 'gt; Export Current Image comme fichier XML/HDF5.
      REMARQUE: Il est nécessaire de définir une voie d'exportation. L'enregistrement lui-même peut prendre plusieurs minutes et dépend de la longueur TLM.
   4. Ouvrez le fichier exporté dans Ellipsoid Surface Projection en cliquant sur Plugins 'gt; BigDataViewer 'gt; Ellipsoid Surface Projection 'gt; Sélectionnez fichier XML.
      REMARQUE: Une nouvelle fenêtre avec des vues sagittales de la chambre d'oeuf et un dialogue pour guider l'utilisateur à travers le traitement apparaîtra. Des détails sur la façon de naviguer dans la vue de la tranche peuvent être trouvés à https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. La fenêtre de dialogue appelée Ovaries Projection a plusieurs onglets. Dans le premier onglet de dialogue appelé boîte de délimitation, définissez les bordures x et y d'une chambre d'oeufs dans le TLM avec la largeur z de la boîte de délimitation (c.-à-d., la profondeur d'une chambre z-pile/oeuf) et appuyez sur l'ensemble (figure 5A).
   6. Pour définir les bordures, faites glisser les boutons à côté de x, y et z ou définissez les coordonnées des nombres dans les cases x, y et z. Assurez-vous que les bordures sont assez généreuses pour obtenir la partie de la chambre d'oeuf d'intérêt dans l'extraction de surface. Les parties sélectionnées de la chambre d'oeuf sont surlignées en rose.
   7. Passez à l'onglet appelé Trouver des objets blobs dans la fenêtre Ovaries Projection. Définir le sigma et la valeur maximale minimale; puis, appuyez sur le calcul pour identifier les signaux d'actomyosine (Figure 5B), qui apparaîtront sous forme de taches vertes. Réessayez cette étape avec différents paramètres jusqu'à ce que suffisamment de taches (environ 100) soient trouvées.
      REMARQUE: Sigma 1-u20123 avec une valeur maximale minimale de 20'u2012100 fonctionne le mieux pour identifier les signaux d'actomyosine des chambres d'oeufs de stade-6 à -8. L'identification des signaux d'actomyosine est une étape cruciale et dépend de la qualité du signal et de sa taille. Il est important de confirmer la taille correcte des blobs existants. Aucune tache verte visible /blobs dans l'image signifie que la prochaine étape ne fonctionnera pas. Parcourez les avions z sélectionnés pour voir les blobs.
   8. Pour concevoir l'ellipsoïde, continuer avec l'onglet appelé Ellipsoïde Fit. Définir des échantillons aléatoires à 10 000, distance de coupure extérieure/intérieure à 1 u201210, puis, cliquez sur Compute (Figure 5C).
      REMARQUE: Plus la distance de coupure est basse, plus l'ellipsoïde désiré sera précis. Après cela, l'onglet appelé Projection s'ouvrira automatiquement et permet la définition de l'extraction de surface. Les paramètres doivent être optimisés.
   9. Continuer plus loin avec l'onglet appelé Projection (Figure 5D). Configurez une distance de projection minimale et maximale (c.-à-d. la largeur de l'ellipsoïde désiré). Il est nécessaire de définir une distance de projection minimale et maximale de sorte que la région ellipsoïde rose définie comprend toute la couche extérieure de la chambre d'oeuf. Définir la distance de tranche (1 est recommandé).
      REMARQUE: Des exemples d'ajustement ellipsoïde incorrect et optimal entraînant des paramètres de projection incorrects et optimaux sont présentés à la figure 6A,C. La mince couche circonférence de l'intérêt peut être définie plus tard. Assurez-vous que la région rose de l'ellipsoïde avec la largeur définie sur la chambre d'oeuf est visible avant d'appuyer sur le calcul. Il est important que l'ellipsoïde désiré (ligne unique rose) s'adapte bien à la surface ellipsoïde d'une chambre d'oeuf afin d'obtenir les meilleurs résultats. Si l'ajustement ellipsoïde n'est pas bon, organiser différents réglages jusqu'à ce que l'extraction de surface désirée soit obtenue.
      1. Définir une largeur de sortie (800 euros) et une hauteur (400 euros) de l'ellipsoïde. Définir à partir de quel moment l'extraction de surface doit être créée (c.-à-d. définir la longueur de l'extraction TLM). Choisissez une projection sphérique ou cylindrique. Retournez Z et alignez Y si nécessaire.
      2. Appuyez sur le calcul pour obtenir une extraction de surface pour les deux canaux dans de nouvelles fenêtres appelées Image. Ajuster la luminosité et le contraste des fenêtres d'image obtenues pour être en mesure de voir les signaux d'actomyosine projetée, en cliquant sur L'image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste.
         REMARQUE: Un exemple de comparaison d'une projection résultant d'un ajustement ellipsoïde incorrect et optimal est montré dans la figure 6B,D.
   10. Si l'extraction de surface semble bonne, enregistrez les images (les deux canaux séparément) comme .tiff. En outre, enregistrez le fichier de fenêtre de journal pour la référence future quant à la façon dont la surface de cette chambre d'oeuf particulière a été extraite.
       REMARQUE: Il s'agit d'informations particulièrement importantes si la couche mince extraite doit être retournée à sa forme dépliée d'origine (pour les développeurs seulement).
   11. Fusionnez les canaux avec un code couleur préféré aux Fidji.
       REMARQUE: Si nécessaire, projetez des couches z-stack sélectionnées avec des signaux d'actomyosine. La projection de couches z-stack sélectionnées est nécessaire lorsque l'objectif d'acquisition change légèrement au fil du temps dans un TLM. Pour de meilleurs résultats, projetez tout au plus une à deux couches z-stack.
   12. Enregistrer les résultats en tant que fichiers .tiff.
       REMARQUE: Des exemples représentatifs de couches minces (surface basale sélective et apicale) qui représentent le signal de myosine II (MRLC::GFP) provenant de l'épithélium follicule de la chambre d'œufs mutants de contrôle et de graisse2 se trouvent dans la figure 8.
2. Traitement des données d'une surface tissulaire extraite sélectivement
   1. Bleach-corriger les TLMs pour compenser la décomposition de l'intensité des étiquettes fluorescentes.
      1. Ouvrez Fidji. Ouvrez un TLM (par exemple, TestMovie2-extraction.tif à partir du fichier supplémentaire 3) en utilisant le fichier 'gt; Open. Sélectionnez l'image pour l'ouvrir.
      2. Divisez les canaux de couleur et les convertir en images 16 bits, si nécessaire, en cliquant sur L'image 'gt; Couleur 'gt; Split Channels. Convertir les canaux en images 16 bits (à partir d'images 32 bits) en utilisant l'image 'gt; Type 'gt; 16-bit.
      3. Effectuer une correction de l'eau de Javel sur les deux canaux en utilisant l'image 'gt; Ajuster 'gt; Bleach Correction 'gt; Simple Ratio 'gt; Intensité de fond 0.0.
         REMARQUE: Si des résultats insatisfaisants sont obtenus, il est nécessaire d'explorer les méthodes de correction dans ce plugin s'adaptent le mieux (par exemple, utiliser Histogram Matching au lieu d'un Ratio Simple).
      4. Fusionnez les canaux à partir des deux images corrigées de l'eau de Javel en cliquant sur Image 'gt; Color 'gt; Merge Channels. Enregistrer l'image fusionnée comme un fichier .tiff en cliquant sur fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff.
         REMARQUE: Ajustez le contraste et la luminosité des canaux si nécessaire.
   2. Segmentation cellulaire pour générer un masque cellulaire pour les TLM
      1. Si Fidji n'est pas déjà ouvert, le rouvrir (et assurez-vous qu'il est à jour en cliquant sur L'aide 'gt; Mise à jour 'gt; Appliquer les changements 'gt; OK).
      2. Si ce n'est pas déjà fait, téléchargez la macro TissueCellSegmentMovie.ijm (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Faites glisser et laissez tomber ce script aux Fidji. Ouvrez le fichier corrigé de l'eau de Javel (p. ex., TestMovie2-bleach.tif du fichier supplémentaire 3, voir aussi 2.2.1).
      4. Divisez les canaux du fichier corrigé de l'eau de Javel en cliquant sur Image 'gt; Couleur 'gt; Split Channels. Ajuster le canal de membrane pour assurer des contours cellulaires clairs en cliquant sur Image 'gt; Ajuster 'gt; Luminosité / Contraste.
      5. Exécutez le script téléchargé sur le canal de membrane cellulaire active du TLM sélectionné en appuyant sur l'icône Exécuter dans le script ouvert. Définir le flou gaussien à 1.500. Définir la sensibilité de détection cellulaire à -1 et cliquez sur OK. Définir la tolérance au bruit estimée à 8 euros pour les TLM acquis avec l'objectif 40x et cliquez sur OK.
         REMARQUE: Afin d'obtenir un masque de cellule agréable, ne modifiez pas ces paramètres ci-dessus. Pour d'autres objectifs, différents paramètres peuvent être nécessaires. Plus l'arrière-plan d'un TLM est net, plus la tolérance au bruit estimée est requise.
      6. Un masque cellulaire généré apparaît dans le TLM analysé et aussi dans une nouvelle fenêtre appelée ParticleStack (G). En outre, une petite fenêtre appelée Action requise apparaît. À partir du masque cellulaire sur le TLM, concentrez-vous uniquement sur les cellules au centre du TLM et sélectionnez celles qui peuvent fournir des contours complets et bien définis tout au long du TLM.
      7. Si les cellules sélectionnées contiennent des contours de cellules artificielles ou supplémentaires, utilisez la fenêtre d'outil de fusion appelée Action requise dans le TLM. Pour ce dernier, suivez les instructions dans la fenêtre.
         REMARQUE: Assurez-vous que les contours des cellules sont bien définis et correspondent à des membranes cellulaires réelles dans un TLM, car toute imprécision peut avoir un impact sur les analyses ultérieures. Des modifications et des modifications supplémentaires, telles que l'élimination des cellules indésirables, peuvent être effectuées plus tard à l'aide de l'outil de gestionnaire De surface (décrit dans le tutoriel ci-dessous).
      8. Lorsque les cellules sélectionnées dans le centre correspondent bien aux membranes cellulaires réelles, enregistrer le ParticleStack comme un fichier .tiff suivant fichier 'gt; Enregistrer comme 'gt; Tiff. Procédez au chargement du masque cellulaire généré et à l'analyse de l'actomyosine dans Surface Manager, comme précédemment effectué dans les sections 1.1.3 et 1.2 (également décrites en détail dans les sections 2.2.3 et 2.3).
   3. Chargement du masque cellulaire généré dans Surface manager
      1. Si le Plugin Surface Manager est déjà installé dans la configuration Fidji utilisée, passez à l'étape 2. Si ce n'est pas le cas, suivez Viktorinova et coll.¹⁶. Pour les développeurs, seul le code source est également disponible¹⁵.
      2. Open Surface Manager en cliquant sur Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D).
         REMARQUE: La fenêtre De gestionnaire Surface affiche plusieurs boutons d'action à droite et une fenêtre vide à gauche. Pour voir tous les boutons d'action, il peut être nécessaire d'étirer la fenêtre dans sa hauteur / largeur. Notez que les délais apparaîtront sous forme de tranches z.
      3. Ouvrez le fichier ParticleStack.tif correspondant dans Surface Manager via File 'gt; Ouvrez et sélectionnez l'image à ouvrir (par exemple, ParticleStack2.tif à partir du fichier supplémentaire 3).
      4. Dans Surface Manager, cliquez sur le bouton Lire le plan d'image et définiz l'index Jacquard à 60 %.
         REMARQUE: Le chargement d'un fichier ParticleStack.tif peut prendre jusqu'à plusieurs minutes, selon la puissance de l'ordinateur.
      5. Une fois chargée, chaque cellule sera assignée avec un numéro S et apparaîtra dans la partie gauche de la fenêtre du gestionnaire de surface (figure 7A).
         REMARQUE: Pour afficher les contours et les noms de cellules pour toutes les cellules, cochez le Show all et affichez les cases à cocher au bas de la fenêtre de gestionnaire Surface. Il est recommandé d'utiliser cette fonction une fois que les numéros de cellule ont été vérifiés pour leur exactitude.
      6. Cliquez sur le premier numéro S; le contour de la cellule importée de ParticleStack.tif apparaît sur le TLM. Vérifiez chaque numéro S importé pour la qualité des contours des cellules dans l'ensemble du TLM et supprimez les cellules indésirables qui affichent des contours cellulaires incorrects. Pour ce faire, mettez en évidence le contour de la cellule et cliquez sur le bouton Supprimer.
         REMARQUE: Il est également possible de corriger les contours imprécis des cellules et d'ajouter de nouveaux contours cellulaires. Ceci est décrit dans la section de discussion.
      7. Enregistrez toutes les cellules corrigées en tant que fichier RoiSet.zip en appuyant sur le bouton Enregistrer sur disque.
         REMARQUE: Si la session doit être interrompue, il est possible de charger le fichier RoiSet.zip dans Surface manager plus tard: ouvrir un TLM à Fidji via Le Fichier 'gt; Ouvrir et sélectionner un TLM. Open Surface manager comme suit: Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Surface manager(3D). Chargez le RoiSet.zip correspondant en cliquant sur la charge à partir du bouton disque et en choisissant le fichier RoiSet.zip approprié (par exemple, TestMovie2-RoiSet.zip). Vérifiez que les masques cellulaires chargés correspondent au TLM chargé.
3. Analyse des impulsions d'actomyosine dans Surface manager
   REMARQUE: Ouvrez Fidji et assurez-vous qu'un TLM et son masque cellulaire correspondant sont ouverts dans Surface manager. Assurez-vous que Fidji est installé et à jour et que le Plugin Surface Manager (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) est installé.
   1. Ouvrez un TLM avec File 'gt; Ouvrez et sélectionnez un TLM pour ouvrir (par exemple, TestMovie2'bleach.tif). Chargez le plugin de gestionnaire de surface par l'intermédiaire de Plugins 'gt; Segmentation 'gt; Gestionnaire de surface(3D). Chargez le masque cellulaire enregistré créé dans le tutoriel ici (par exemple, ParticlesStack2.tif) via le fichier 'gt; Ouvrez et sélectionnez un masque cellulaire (par exemple, ParticlesStack2.tif). Chargez le retour sur investissement correspondant (p. ex., TestMovie2-RoiSet.zip).
   2. Passez au canal d'intérêt dans le TLM sélectionné.
      REMARQUE: Pour faire la distinction entre les canaux, suivez le code de couleur indiqué autour du TLM.
   3. Dans Surface manager, cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir la fenêtre appelée Valeur grise moyenne Tranche par tranche ( Figure7B). Notez que les valeurs d'intensité moyenne/médiane des signaux d'actomyosine dans un canal analysé donné dans les contours définis de la cellule au fil du temps seront affichées, ainsi que d'autres paramètres liés à la zone cellulaire et à la forme des cellules.
      REMARQUE: Les valeurs d'intensité sont dans a.U.; la zone cellulaire est en pixels et doit être convertie en micromètres carrés.
   4. Enregistrer les valeurs obtenues comme un fichier feuille de calcul: cliquez sur la fenêtre Statistiques, Fichier 'gt; Enregistrer comme.
      REMARQUE: Il est possible de vérifier les valeurs statistiques obtenues plus tard, comme suit. Ouvrez le TLM corrigé de l'eau de Javel aux Fidji. Gestionnaire Open Surface. Chargez le RoiSet.zip correspondant au TLM en appuyant sur la charge à partir du bouton disque et ouvrez le fichier. Le masque enregistré avec les contours de cellule sera téléchargé et les noms des cellules apparaîtront dans la fenêtre gauche du gestionnaire Surface. Cliquez sur le bouton Statistiques pour obtenir des valeurs statistiques.
      REMARQUE: En ce qui concerne une analyse manuelle des signaux d'actomyosine subcellulairesindividuels, il n'est pas possible d'effectuer une analyse manuelle des signaux subcellulaires d'actomyosine à l'échelle de tissu. L'optimisation est nécessaire pour l'analyse des signaux individuels d'actomyosine à l'échelle de semi-tissu, comme souligné dans la section de discussion.

Representative Results

Ce protocole permet aux scientifiques d'étudier le comportement des réseaux d'actomyosine dans les tissus épithéliales. Ceci n'est possible que lorsqu'une analyse détaillée du comportement de l'actomyosine à l'échelle cellulaire locale (quelques cellules) est combinée à une analyse similaire à l'échelle tissulaire (de nombreuses cellules). Cependant, les tissus épithélialsont sont souvent courbés et l'extraction d'une mince couche de ces tissus n'était pas possible auparavant, comme le montrent les chambres d'œufs Drosophila (figure 1). Le protocole présenté ici fournit aux utilisateurs des instructions simples décrivant comment analyser le comportement d'actomyosine à ces deux échelles (Figure 2).

La première partie de ce protocole se concentre sur les instructions concernant l'analyse des impulsions d'actomyosine à l'aide du plugin De gestionnaire de surface ( figure3). Il décrit également comment analyser manuellement le comportement individuel d'actomyosine à l'échelle cellulaire locale (Figure 4). La deuxième partie de ce protocole explique comment extraire une fine couche de tissu épithélial à l'aide du plugin elliptinoïde de projection de surface (figure5 et figure 6). Ce n'est qu'alors qu'il est possible d'analyser les impulsions d'actomyosine à l'échelle tissulaire à l'aide du plugin Surface manager (Figure 7). Résultats représentatifs et une comparaison du comportement d'actomyosine dans le contrôle rotatif et les chambres d'oeufs mutantes de Drosophila mutantes statiques 2 à l'échelle cellulaire et tissulaire locale est montrée dans la figure 8 et dans le film correspondant 1, Film 2, Film 3, Film 4, Film 5, et Film 6 (pour plus de détails, voir Figure 8).

Figure 1 : Extraction sélective d'une mince couche d'une surface de tissu incurvée. (A) Afin d'obtenir suffisamment d'informations sur les réseaux d'actomyosine dans l'épithélium courbe circonférentiel, il est nécessaire d'acquérir une cheminée profonde (rose) sur la majorité d'un tissu visible comme indiqué pour l'épithélium du follicule courbé (gris) des chambres d'oeufs de Drosophila. (A') Cependant, une simple projection d'une telle z-pile conduit au mélange de réseaux entiers d'actomyosine dans les cellules folliculaires. Myosin II visualisé avec MRLC::GFP (vert) montre la région intérieure fortement exprimante (apical) des cellules follicules dans une telle z-projection et presque aucune information du côté basal (extérieur), où Myosin II affiche un phénotype de polarité de cellules planaires fortes, mais son l'intensité du signal est faible¹². Pour éviter un tel mélange comme indiqué dans le panneau A', nous avons développé un plugin convivial, basé à Fidji appelé Ellipsoid Surface Projection dans BigDataViewer¹⁸ qui permet (B) l'extraction sélective d'une couche définie et mince (rose ) de l'actomyosine d'un épithélium incurvé (B') comme indiqué pour Myosin II (vert) dans une extraction choisie du côté basal (extérieur) de l'épithélium follicule. Comparez la différence de signal de Myosin II (MRLC::GFP) dans les panneaux A' et B'. Notez le modèle polarisé planaire de Myosin II dans le panneau B'. Les contours de la cellule sont en rouge. Le côté antérieur est sur la gauche. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Réseau d'actomyosine polarisé planaire aux écailles cellulaires et tissulaires locales. L'imagerie de l'actomyosine à différentes échelles permet l'analyse de différents nombres de cellules épithéliales, à savoir (A) jusqu'à 15 cellules à l'échelle cellulaire locale et (B) 50-100 cellules à l'échelle tissulaire dans l'épithélium follicule de culture Chambres d'oeufs Drosophila. Nonmuscle Myosin II est visualisé avec MRLC::GFP (vert) et le génotype de la ligne transgénique utilisée est spécifié dans le Tableau des matériaux. Les contours de la cellule sont en magenta. Le côté antérieur est sur la gauche. Barres d'échelle de 5 m (A); 50 m (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Exemple de l'analyse des impulsions de Myosin II dans Surface manager à l'échelle cellulaire locale. (A) Une pile de particules est chargée dans le gestionnaire de surface. Notez que toutes les cellules identifiées dans le TLM apparaissent dans la fenêtre de gestionnaire Surface. Il est important de supprimer toutes les cellules indésirables ou incomplètes à travers un TLM. (B) Les statistiques obtenues sur Myosin II (MRLC::GFP) pour les cellules sélectionnées sont affichées dans la fenêtre appelée Moyenne de valeur grise Tranche par tranche dans le gestionnaire de surface. MRLC::GFP est montré en vert tandis que les membranes cellulaires sont en rouge. Le côté antérieur est sur la gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Exemple de l'analyse manuelle des signaux myosine II individuels à l'échelle cellulaire locale. (A) Un sous-film sélectionné de 30 s-long est placé à côté de (B) sa projection de temps. Notez qu'à la projection temporelle, Myosin II (MRLC::GFP) montre des lignes de trajectoire plus longues (voir panneau B) dans des cellules individuelles que dans un laps de temps individuel (voir panneau A). Les lignées individuelles dans les cellules doivent être analysées pour leur direction angulaire par rapport à l'axe antérieur-postérieur des chambres d'oeufs. (C) Notez que les Fidji ne mesurent pas 0 à 360 degrés, mais seulement 0 à 180 degrés pour les signaux pointant vers le haut et 0 à 179 degrés pour les signaux pointant vers le bas. Soyez conscient que 0 est atypiquement placé sur la droite d'une image analysée. (D) Sur la base de ces informations, les lignes qui se déplacent avec (en rose) ou contre (vers le bas en jaune) la direction de la rotation épithéliale dans une chambre d'oeufs particulière doivent être binées pour identifier si la rupture de symétrie des signaux analysés est présente dans un cellules, puis pour plusieurs cellules dans le tissu analysé. MRLC::GFP est montré en vert tandis que les membranes cellulaires sont en rouge. Le côté antérieur est sur la gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Exemple de génération d'un ajustement ellipsoïde à l'échelle tissulaire. Afin d'adapter un ellipsoïde sur une chambre d'oeufs en utilisant le plugin ellipsoïde de projection de surface dans BigDataViewer, il est nécessaire de définir (A) une boîte de délimitation qui inclut la majorité du tissu numérisé. Ensuite, il est important (B) d'identifier les points de signal, qui sont une condition préalable pour une génération optimale d'ajustement ellipsoïde. (C) Lorsque l'ajustement ellipsoïde n'est pas optimal et n'entoure pas bien une chambre d'oeufs, cela entraîne (D) une mauvaise extraction de la couche tissulaire. Voir les résultats d'extraction et de projection ultérieure dans la figure 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Comparaison d'un ajustement ellipsoïde incorrect et optimal et des projections de surface correspondantes. (A) Lorsque l'ellipsoïde n'est pas correctement installé, (B) la projection finale de la surface ne fournira pas de données complètes sur le signal dans la mince couche du tissu analysé. (C) Cependant, lorsqu'il est monté de façon optimale, il garantit une détection de signal égal d'une fine couche dans le tissu. (D) Notez que la projection de surface optimale contient plusieurs couches minces comme une pile zprojetée en surface au fil du temps, qui peut être séparée par la suite comme indiqué à la figure 8. Les signaux de myosine II (MRLC :GFP, blanc) et les signaux membranaires (blancs) sont d'abord fusionnés avant la projection (panneaux A et C),mais sur la projection de surface elle-même, ces canaux sont séparés (voir les projections de Myosin II dans les panneaux B et D). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Exemple de l'analyse des impulsions de Myosin II dans Surface manager à l'échelle tissulaire. (A) Une pile de particules est chargée dans le gestionnaire de surface. Notez que toutes les cellules identifiées dans le TLM apparaissent dans la fenêtre de gestionnaire Surface. Il est important de supprimer toutes les cellules indésirables ou incomplètes à travers un TLM. (B) Les statistiques obtenues sur les impulsions Myosin II (MRLC::GFP) (moyenne ou médiane) pour certaines cellules au fil du temps sont affichées dans la fenêtre appelée Valeur grise moyenne Tranche par tranche dans le gestionnaire de surface. Notez que des points Plus forts de Myosin II peuvent influencer la mesure finale de l'intensité intrinsèque de Myosin II. Ceci résulte du problème que ces points de Myosin II peuvent sembler migrer au-delà du contour de cellule où il y a une définition incorrecte de contour de cellule dans le masque de cellule généré. MRLC::GFP est montré en vert tandis que les membranes cellulaires sont en rouge. Le côté antérieur est sur le dessus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Résultats représentatifs d'un réseau de Myosin II dans l'épithélium folliculium de Drosophila. Exemples représentatifs du comportement dynamique de Myosin II (MRLC::GFP) (A et B) à l'échelle cellulaire locale et (C-F) à l'échelle de tissu pour le contrôle et les chambres mutantes d'oeufs de Drosophila de fat2. Voir Tableau des matériaux pour obtenir des renseignements détaillés sur les génotypes utilisés. Notez que les signaux MRLC::GFP se déplacent perpendiculairement à l'axe antérieur-postérieur (AP) des chambres d'oeufs témoins. Cette polarité se perd dans les chambres d'œufs mutants fat2 et conduit à des impulsions anisotropiques Myosin II / oscillations¹². Après analyse manuelle des petits signaux MRLC ::GFP (300 m) et la quantification de leur mouvement directionnel angulaire tel que décrit dans le protocole, la rupture de symétrie des signaux MRLC::GFP peut être observée avec une préférence contre la direction de l'épithélial rotation dans une chambre d'oeufs analysée¹² (figure 4). Les films correspondants sont: panneau A - Film 1, panneau B - Film 2, panneau C - Film 3, panneau D - Film 4, panneau E - Film 5, et panneau F Film 6. Les contours des cellules sont représentés en magenta. Le côté antérieur est sur la gauche. Barres d'échelle de 5 m (A et B) et 50 m (C-F). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Paramètres recommandés pour l'imagerie à haute vitesse à courte durée à l'échelle cellulaire locale :
Ⅰ.	Tissu d'intérêt librement placé dans le milieu de culture (c.-à-d. pas de feuillets de couverture, couvertures flexibles, etc.)
Ⅱ.	Objectif de 63x d'eau avec ouverture numérique -1,3
Ⅲ.	Microscope confocal inversé
Iv.	Avion unique
contre.	Intervalles de temps de 6-12 s
Vi.	5-10 minTLMs
Vii.	Exigence de stockage de données par TLM jusqu'à 100 Mo
Paramètres recommandés pour l'imagerie à basse vitesse à long terme à l'échelle tissulaire :
Ⅰ.	Tissu d'intérêt librement placé dans le milieu de culture (c.-à-d. pas de feuillets de couverture, couvertures flexibles, etc.)
Ⅱ.	Objectifs d'eau 40x et ouverture numérique 1,3
Ⅲ.	Microscope inversé de disque de filature
Iv.	z-stacks pour acquérir environ la moitié d'une chambre d'oeufs
contre.	Intervalles de 60 s
Vi.	Au moins 30 mints TLMs
Vii.	Exigence de stockage de données ca. 1 Go

Tableau 1 : Paramètres d'imagerie recommandés.

Film 1: Comportement dynamique représentatif de Myosin II (MRLC::GFP) à l'échelle cellulaire dans une chambre d'oeufs drosophila de contrôle. Notez que MRLC::GFP (vert) préfère se déplacer perpendiculairement à l'axe AP des chambres d'oeufs. Les contours des cellules sont en magenta. Vue basale. Le côté antérieur est sur la gauche. Barre d'échelle de 5 m. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. Cliquez à droite pour télécharger.

Film 2: Comportement dynamique représentatif de Myosin II (MRLC::GFP) à l'échelle cellulaire dans une chambre d'oeufs mutante fat2 Drosophila. Notez que MRLC::GFP impulsions (vert) et n'est plus planaire aligné perpendiculairement à l'axe AP des chambres d'oeufs statiques. Les contours des cellules sont en magenta. Vue basale. Le côté antérieur est sur la gauche. Barre d'échelle de 5 m. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. Cliquez à droite pour télécharger.

Film 3: Comportement dynamique représentatif de Myosin II basale (MRLC::GFP) à l'échelle tissulaire dans une chambre d'oeufs drosophile témoin. Notez que seule une mince couche basale (extérieure) MRLC::GFP est extraite de près de la moitié de l'épithélium follicule d'une chambre d'oeufs. MRLC::GFP est en vert et les contours des cellules sont en magenta. Notez la différence dans le niveau de détail du mrLC obtenu::GFP comportement du signal ici (représentant l'échelle tissulaire) par rapport au film 1 (représentant l'échelle cellulaire). Le côté antérieur est sur la gauche. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. Cliquez à droite pour télécharger.

Film 4: Comportement dynamique représentatif de Myosin II basal (MRLC::GFP) à l'échelle de tissu dans une chambre mutante de gros2 d'oeufs de Drosophila. Notez que MRLC::GFP (vert) impulsions fortement sur le côté basal de près de la moitié de l'épithélium follicule d'une chambre d'oeufs mutant fat2 et ne parvient pas à générer la force synchronisée nécessaire pour favoriser la rotation épithéliale. Les contours des cellules sont en magenta. Le côté antérieur est sur la gauche. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. Cliquez à droite pour télécharger.

Film 5: Comportement dynamique représentatif de Myosin II apanique (MRLC::GFP) à l'échelle de tissu dans une chambre d'oeufs de drosophila de contrôle. Seule une mince couche MRLC::GFP est extraite du côté apaïque (intérieur) de près de la moitié de l'épithélium follicule d'une chambre d'oeufs. Notez que MRLC::GFP (en vert) montre un comportement dynamique différent ici au côté apaïque par rapport au côté basal de l'épithélium follicule (comme le montre le film 3). Les contours des cellules sont en magenta. Le côté antérieur est sur la gauche. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. Cliquez à droite pour télécharger.

Film 6: Comportement dynamique représentatif de L'apical Myosin II (MRLC::GFP) à l'échelle des tissus dans une chambre d'oeufs mutante Fat2 Drosophila. Comportement dynamique altéré de MRLC :GFP (vert) extrait d'une région acodique mince de presque la moitié de l'épithélium follicule d'une chambre d'oeuf mutante de graisse2 statique. Les contours des cellules sont en magenta. Le côté antérieur est sur la gauche. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo. Cliquez à droite pour télécharger.

Discussion

Étapes critiques et dépannage pour la dissection et la culture des chambres d'oeufs

Si trop de mouches sont placées dans une petite fiole, la nourriture de mouche peut devenir boueuse après 2-3 jours en raison des quantités étendues de larves d'alimentation et les mouches adultes se coincer dans la nourriture de mouche. Dans un tel cas, retournez le reste de ces mouches dans une nouvelle fiole avec des aliments frais et réduire leur nombre. En particulier, exclure les femelles qui étaient coincées dans la nourriture.

Le mélange Schneider (SM) doit être préparé à l'avance et peut être conservé à 4 oC pendant 14 jours. Sachez qu'un mélange plus ancien peut contenir des cristaux qui peuvent endommager la surface des chambres d'œufs. Mélangez toujours le SM avec de l'insuline fraîchement ajoutée et laissez-lui suffisamment de temps pour atteindre la température ambiante. Cela protège les chambres d'oeufs contre le choc froid, qui peut avoir un impact négatif sur la croissance des microtubules et l'alignement planaire du cytosquelette (comme on le voit dans l'aile en développement Drosophila ¹⁹).

Les chambres d'oeufs et les ovarioles sélectionnés sont très fragiles et, en raison de leur petite taille, peuvent flotter dans le SMI (SM avec de l'insuline). Il est recommandé de les laisser s'enfoncer spontanément dans le SMI. Ils s'en tiennent aussi souvent à l'outil de dissection forceps/cactus. Dans un tel cas, laissez-les se libérer des dispositifs de dissection en les déplaçant doucement dans le SMI. Évitez de les presser et de les toucher directement en tout temps. Si nécessaire, excluez ces chambres d'œufs/ovarioles du protocole ultérieur.

Comme un stéréoscope de dissection n'est pas fiable pour l'identification des chambres d'oeufs endommagées/ovarioles, les chambres d'oeufs/ovarioles devraient être vérifiées utilisant un colorant de CellMask ou de FM 4-64 sous un microscope confocal/spinning de disque. Les chambres endommagées d'oeuf montrent la coloration extrême par rapport à un fond intact de tissu de chambre d'oeuf. N'achetez jamais un TLM avec des taches de teinture solides.

Étapes critiques et dépannage pour l'imagerie in vitro en direct des chambres d'oeufs

Si les chambres d'oeufs librement placées dans le SMI se déplacent encore, vérifiez à nouveau sous le microscope confocal pour voir s'il y a encore des restes négligés de feuille de muscle et de débris flottant dans le SMI. Retirez-les et réessayez. Parmi les chambres d'oeufs, 90 % devraient être stables et immobiles lors de l'imagerie subséquente.

Pour vous assurer qu'une chambre d'œufs sélectionnée/ovariole est stable, utilisez l'imagerie à haute vitesse (6 s intervalles) pendant 1 min. Les chambres d'œufs instables se déplaceraient à ce stade. Cependant, il est recommandé de regarder l'enregistrement time-lapse entier pour être en mesure de corriger doucement un mouvement inattendu potentiel de la chambre d'oeufs image. Cela peut être fait en déplaçant la scène microscopique / table, qui tient le plat Petri avec les chambres d'oeufs de culture / ovarioles, à la position d'origine de sorte que la chambre d'oeuf de l'intérêt est à nouveau dans l'image, fenêtre ciblée.

Arrêtez l'imagerie si un mouvement soudain et inattendu de la chambre d'oeufs image apparaît. Vérifiez l'amorti de la table du microscope, et évitez de vous promener près du microscope pendant le temps d'acquisition, car cela peut entraîner une interruption de l'acquisition de l'image en raison des vibrations causées.

Si le colorant membranaire cellulaire n'est pas visible après 30 min et que la ligne laser utilisée est correcte, ajoutez plus de colorant et augmentez sa concentration pour la prochaine acquisition.

Si les signaux d'actomyosine semblent flous, vérifiez le NA de l'objectif utilisé. Un NA inférieur à 1,3 diminuera la qualité d'imagerie. En outre, assurez-vous que l'huile d'immersion utilisée a été appliquée correctement à l'objectif de l'eau 63x. Ajoutez-le ou remplacez-le si nécessaire.

Si les chambres d'oeufs rétrécissent et que les membranes cellulaires observées se déforment, vérifiez si le couvercle est correctement fermé. Si le couvercle est manquant ou mal fermé, les chambres d'oeufs peuvent sécher en raison de l'évaporation de SMI au cours du temps d'acquisition.

Si la rotation des chambres d'oeufs ralentit ou s'arrête, diminuez la puissance du laser. Si un trou apparaît dans la chambre d'oeufs, il a été brûlé par le laser. Diminuez la puissance laser.

Si l'actomyosine signale l'eau de Javel après 2 min pendant l'acquisition de TLM, diminuez la puissance de laser et augmentez l'amplification de signal dans le logiciel de microscope.

Une fois qu'un TLM de l'épithélium follicule d'une chambre d'oeuf a été acquis, il est recommandé d'éviter l'imagerie encore dans la même région de tissu de cette chambre d'oeuf. Cependant, comme les chambres d'oeufs tournent autour de leur axe AP, il est possible de répéter l'acquisition d'un TLM en utilisant cette chambre d'oeufs intacte après environ 30 min. Pendant l'imagerie de l'épithélium folliculoium dans une chambre d'oeufs, d'autres chambres d'oeuf ne seront pas blanchies/endommagées même si elles sont situées dans le même ovariole ou dans un autre ovariole dans le SMI.

Si toutes ces exigences sont remplies, le pourcentage de chambres d'oeufs avec succès image devrait être d'environ 90% - 100% pour les stades 6-8, environ 50%-60% pour les stades 3-5, et environ 20%-30% pour les étapes 1 - 2. L'échec est principalement dû au mouvement des chambres d'oeufs ou aux dommages à eux pendant leur dissection/manipulation.

Étapes critiques et dépannage pour le traitement des données

Pendant la génération de masques en utilisant le script fourni aux Fidji, il peut arriver qu'il ya beaucoup de contours de cellules générées qui ne reflètent pas les membranes cellulaires réelles dans un TLM. Ceci est souvent causé par un bruit de fond élevé, en particulier lorsque des colorants pour les membranes de cellules taquines sont utilisés. Dans un tel cas, pour éviter la correction fastidieuse des contours cellulaires indésirables dans le masque généré, exécutez à nouveau la segmentation et définiz les paramètres au meilleur ajustement. Cela peut être fait en ajustant le paramètre de tolérance au bruit estimé.

Lors du chargement de l'un des fichiers ParticleStack.tif contenant des contours de cellules dans Surface manager, le temps de chargement s'adapte linéairement avec le nombre de contours de la cellule et peut prendre plusieurs minutes. Si le chargement est perturbé ou incorrect, répétez-le. Assurez-vous que la fenêtre de téléchargement est au point et qu'aucun autre programme n'est utilisé.

Parfois, un contour de cellule doit être corrigé dans certains cadres; dans un tel cas, utilisez le bouton Brosse. Dessinez le contour de la cellule correcte dans un cadre particulier en faisant glisser la souris autour de la membrane cellulaire. Déplacez-vous vers un cadre différent du TLM, puis retournez au délai avec la correction : le contour incorrect de la cellule doit maintenant être remplacé. Ensuite, repassez le cadre suivant pour corriger celui-là. L'outil Brush passera désormais en mode effacement. Si nécessaire, corrigez les contours dans les prochaines périodes en appuyant sur le contour de la cellule existante, puis en appuyant sur le bouton «Ajouter» pour créer un nouveau contour de cellule. Supprimez l'ancien numéro S de la fenêtre de gestionnaire Surface et renommez le contour de la nouvelle cellule en appuyant sur le bouton Rename si nécessaire.

Si une cellule importante entière est manquante tout au long d'un TLM, créer un nouveau contour de masque en appuyant sur Unselect 'gt; Polygon. Créez un nouveau contour cellulaire dans le premier cadre du TLM en cliquant le long de la membrane cellulaire. Ensuite, allez à la dernière image de la TLM et faire la même chose pour la cellule sélectionnée. En exécutant le film à temps, les contours de la cellule seront interpolés. Corriger avec l'outil Brush si nécessaire. Une fois terminé, appuyez sur le bouton «Ajouter» et renommer le contour de la cellule en appuyant sur le bouton Rename. Plus il y a de points/clics pour créer un nouveau contour de cellule, plus l'interpolation fonctionne.

Outre la rotation épithéliale, les TLM sont parfois affectés par des mouvements indésirables. Par conséquent, il est recommandé de corriger une telle dérive tissulaire dans ces TLMs. Ce faisant, les TLM sont également corrigés pour la rotation épithéliale des chambres d'oeufs, et les membranes cellulaires deviennent rigides. Cela facilite l'analyse manuelle des signaux d'actomyosine. Cependant, une telle approche ne permet pas aux scientifiques de distinguer si les signaux d'actomyosine observés se déplacent ou sont statiques par rapport à la membrane cellulaire. Si une distinction entre les mouvements statiques et actifs des signaux d'actomyosine est l'objectif d'une telle analyse, aucune correction de dérive tissulaire ne devrait être appliquée. Nous avons constaté que la majorité des signaux d'actomyosine se déplacent activement par rapport à la membrane cellulaire et seulement une partie mineure d'entre eux semblent statiques.

Étapes critiques et dépannage pour l'analyse des signaux subcellulaires d'actomyosine

Si les statistiques générées contiennent des valeurs aberrantes, assurez-vous que les valeurs extrêmement faibles ou élevées par rapport à l'ensemble des données reflètent vraiment le comportement dans la cellule et ne sont pas des artefacts. Cela peut être fait en identifiant la cellule contenant les valeurs aberrantes et en vérifiant la qualité du contour de la cellule au moment où la valeur faible/élevée a été mesurée. Souvent, de telles valeurs extrêmes résultent de contours de cellules défectueux qui mesurent incorrectement une partie d'une autre cellule. Cela peut être particulièrement évident lorsque de gros blobs interfèrent avec le contour cellulaire d'une cellule voisine. Dans un tel cas, il est crucial de corriger les contours de la cellule et de répéter la mesure.

Pour faciliter la quantification, analysez les signaux d'une surface cellulaire particulière et continuez un par un jusqu'à ce que toutes les cellules soient analysées dans un sous-film. Les résultats de l'analyse manuelle des signaux subcellulaires d'actomyosine peuvent ne pas montrer la rupture de symétrie dans une cellule et une chambre d'oeuf particulière. Nous avons constaté que l'actomyosine ne brise pas clairement la symétrie par rapport au mouvement de tissu dans le lt;10% des chambres tournantes d'oeuf (étapes 6-8). Ce pourcentage est augmenté autour de l'étape 4¹². Nous avons également constaté qu'il n'y a aucune différence si 5 min ou 10 min sontanalysés dans l'identification de la direction préférée du mouvement de signal d'actomyosin dans une chambre d'oeuf12 .

Étapes critiques et dépannage pour l'extraction sélective des signaux d'actomyosine des tissus incurvés

La mauvaise taille des blobs (signaux identifiés) n'entraînera aucun blobs et le programme gèlera à l'étape suivante. Dans ce cas, la force-quitter Fidji et nouvellement redémarrer le plugin Ellipsoid Surface Projection. Faites de même lorsque le programme ne réagit pas après avoir appuyé sur Compute. C'est souvent une indication que des paramètres inappropriés ont été choisis.

S'il y a trop de blobs et/si elles sont concentrées vers un côté de la chambre d'oeuf analysée, ceci peut avoir un impact l'ellipsoïde conçu et ne pas fournir l'ajustement correct pour la chambre d'oeuf. Retournez à l'identification blob et essayez d'arranger leur taille dans la combinaison avec la sélection x-, y-, et z-axe de la chambre d'oeuf. Un échec à générer un bon ajustement ellipsoïde se produit également souvent lorsque des paramètres de distance de coupure inappropriés sont utilisés.

Les projections obtenues peuvent parfois sembler floues, ou peut-être le plan z obtenu se déplace réellement entre les couches cellulaires près de la surface de la chambre d'oeuf. C'est habituellement un signe d'un ellipsoïde mal adapté où une région de l'ellipsoïde est fixée trop loin de la chambre d'oeuf. Essayez d'adapter l'ellipsoïde afin qu'il maintienne la même distance de la circonférence de la chambre des œufs.

Limites de la méthode et des approches novatrices

Cette culture libre des chambres d'oeufs omet l'aplatissement subtil de la surface d'une chambre d'oeuf. À cette fin, cette méthode a ses avantages et ses inconvénients. Lors de l'utilisation de la microscopie confocale, il fournit aux utilisateurs une imagerie à haute résolution et à haute vitesse qui révèle de façon fiable le comportement d'actomyosine dans les cellules à la circonférence des chambres d'oeufs pendant une courte période de temps (5-10 min). Cependant, ce faisant, il limite la taille d'un seul plan qui peut être photographié avec une microscopie confocale au fil du temps. En général, il est possible d'imager jusqu'à 15 cellules par chambre d'oeufs aux stades 6-8, mais seulement environ deux cellules dans les chambres d'oeufs aux étapes 1-5. Par conséquent, nous avons défini cette méthode ici comme étant approprié seulement pour l'échelle cellulaire locale.

Pour surmonter ces limites de taille qui sont causées par la taille limitée d'un seul plan confocal, nous avons développé une approche alternative basée sur les Fidji appelée Ellipsoid Surface Projection, pour une utilisation à l'échelle tissulaire. Cela combine la microscopie de disque filature avec une extraction semi-interactive de surface des chambres d'oeufs à l'échelle de tissu. De cette façon, les signaux d'actomyosine peuvent être obtenus en même temps pour plus de 50-100 cellules d'une chambre d'oeuf analysée. Il est important de noter que cette approche génère de très grands ensembles de données des données acquises (octets de giga), a une résolution inférieure (il utilise un objectif 40x vs 63x), et fournit également une vitesse d'imagerie plus lente (il faut 60 s pour scanner la moitié du tissu d'un ovule cham ber [étapes 6-8] et, en tant que tel, il est 10fois plus lent que la méthode limitée plan confocal).

Comparé à d'autres logiciels existants pour extraire des projections en couches à partir de surfaces parametrisées, le plugin développé pour ce protocole est axé sur la facilité d'utilisation et la rétroaction visuelle interactive à chaque étape du processus. D'autres outils, tels que l'ImSaNE²⁰de MATLAB, utilisé par Chen et coll.²¹, se concentrent sur la manipulation d'une grande variété de modèles de surface paramétsisés et non paramétrés et de diverses méthodes de projection. Par exemple, ImSaNE exige que les données soient prétraitées et alignées d'une manière particulière et nécessite en partie des outils externes à des étapes intermédiaires. En revanche, le plugin présenté ici gère toute image 3D/4D/5D (séquence) qui peut être ouverte aux Fidji sans prétraitement externe. Bien qu'ImSaNE soit très configurable (programmable) en éditant des scripts MATLAB, nous fournissons un ensemble minimal d'options dans un flux de travail adapté au problème spécifique discuté ici. Chaque étape du flux de travail interactif fournit des résultats qui peuvent être immédiatement inspectés visuellement et ajustés si nécessaire.

La décision quant à l'une de ces approches d'imagerie, l'échelle cellulaire ou tissulaire locale, est la meilleure pour une expérience particulière, dépend uniquement de la question scientifique à répondre (c.-à-d., plus haute contre faible résolution; court vs long temps d'acquisition). Un bon compromis entre ces deux échelles pourrait être de combiner les deux approches, obtenant ainsi l'imagerie des signaux d'actomyosine à l'échelle semi-tissu (c.-à-d., 20-30 cellules). Cela nécessite un microscope à disque filature, une lentille d'eau 63x avec NA 1,3, et des paramètres de z-pile établis pour 20 à 30 cellules d'une chambre d'oeufs. Cette z-pile beaucoup moins profonde (contrairement à la z-pile requise pour l'acquisition de la moitié d'une chambre d'oeufs) permet un balayage plus rapide de moins de 60 s. Le temps gagné ici peut être utilisé soit pour l'acquisition répétée de z-stack pour accélérer l'imagerie ou pour une récupération d'échantillon (entreles de temps) entre les z-stacks individuels. Avec ce dernier, un temps d'acquisition plus long (-30 min) de TLMs de chambres d'oeufs tournantes peut être atteint. Cette approche semi-tissu garantit une résolution suffisante pour les signaux d'actomyosine et la formation image de plus de cellules en même temps sur de plus longues périodes de temps.

Applications et vision futures

Les deux méthodes décrites (à l'échelle cellulaire et tissulaire locale) fournissent une approche simple et peu coûteuse (à l'exclusion des dispositifs de microscope) avec des effets secondaires limités sur le réseau d'actomyosine et peuvent être mises en œuvre et facilement adoptées pour d'autres tissus animaux disséqués. La seule condition préalable ici est un protocole de culture existant dans un plat Petri pour un tissu incurvé d'intérêt, transgènes disponibles, et des marqueurs ou des méthodes d'étiquetage.

En combinaison avec la microscopie de fluorescence de feuille de lumière^22,il est également possible d'imager la machinerie d'actomyosin dans toto (c.-à-d., image de la surface cirinarne externe complète des chambres d'oeufs de Drosophila simultanément et puis plus tard se dérouler à l'aide du plugin Ellipsoid Surface Extraction). Cependant, il y a quelques limitations qui doivent être résolues en termes de convenance pour l'imagerie à grande vitesse des signaux d'actomyosine, à savoir 1) l'intégration des chambres d'oeufs dans un agarose de fusion de point bas ou leur collage à un capillaire pendant l'imagerie ; ii) une faible ouverture numérique des lentilles d'eau usagées qui ne fournissent pas une résolution suffisante du signal d'actomyosine; iii) le temps supplémentaire nécessaire pour acquérir plusieurs angles de chambres d'oeufs, ce qui empêche l'imagerie à haute vitesse.

À cette fin, il est prévisible que, grâce au raffinement des paramètres du microscope tels que la vitesse à scanner à travers le tissu épithélial et l'amélioration des lentilles microscopiques usagées, l'analyse détaillée des machines à actomyosine permettra, à l'avenir, des résultats prometteurs à haute résolution à obtenir au tissu et à l'échelle toto sur de longues périodes de temps.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 mL Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.