Análise da dinâmica da Actomiosina em escalas celulares e teciduais locais usando filmes de lapso de tempo das câmaras de ovos de Drosophila cultivadas

Summary

Este protocolo fornece uma metodologia Fiji-baseada, user-friendly junto com instruções diretas que explicam como analisar confiantemente o comportamento do actomiosina em pilhas individuais e em tecidos epithelial curvados. Nenhuma habilidade de programação é necessária para seguir o tutorial; todas as etapas são executadas de forma semiinterativa usando a interface gráfica do usuário de Fiji e plugins associados.

Abstract

Os ovos imaturos da Drosophila são chamados de câmaras de ovos, e sua estrutura se assemelha a órgãos primitivos que sofrem alterações morfológicas de uma rodada a uma forma elipsóide durante o desenvolvimento. Esse processo de desenvolvimento é chamado de oogênese e é crucial para gerar ovos maduros funcionais para garantir a próxima geração de moscas. Por estas razões, as câmaras de ovo serviram como um modelo ideal e relevante para compreender o desenvolvimento de órgãos animais.

Diversos protocolos in vitro da cultura foram desenvolvidos, mas há diversas desvantagens a estes protocolos. Um envolve a aplicação de várias coberturas que exercem uma pressão artificial nas câmaras de ovos imaged, a fim de imobilizá-los e aumentar o plano de aquisição imaged da superfície circunferencial das câmaras de ovos analisadas. Essa abordagem pode influenciar negativamente o comportamento da maquinaria de actomiosina fina que gera o poder de girar as câmaras de ovo em torno de seu eixo mais longo.

Assim, para superar esta limitação, nós cultura câmaras de ovo de Drosophila livremente na mídia, a fim de analisar de forma confiável a maquinaria de actomiosina ao longo da circunferência das câmaras de ovo. Na primeira parte do protocolo, fornecemos um manual detalhando como analisar a maquinaria de actomiosina em um plano de aquisição limitado na escala celular local (até 15 células). Na segunda parte do protocolo, fornecemos aos usuários um novo plugin baseado em Fiji que permite a extração simples de uma camada fina definida da superfície circunferencial das câmaras de ovos. O seguinte protocolo descreve então como analisar sinais da actomiosina na escala do tecido (> 50 pilhas). Finalmente, nós apontemos as limitações destas aproximações nas escalas locais do celular e do tecido e discutimos seu desenvolvimento futuro potencial e aplicações possíveis.

Introduction

O desenvolvimento contínuo de novas tecnologias de imagem e software com aplicações nas ciências da vida tem proporcionado um enorme impacto na compreensão dos princípios básicos da vida. Um dos principais desafios é a visualização confiável dos processos de desenvolvimento em combinação com sua imagem ao vivo em vários tecidos. Os tecidos são partes de órgãos e corpos e, como tal, a maioria não são facilmente acessíveis para a imagem. Portanto, protocolos que permitam sua dissecção e cultivo in vitro foram desenvolvidos para Visualizar eventos biológicos que refletem suficientemente a situação in vivo dentro de um corpo vivo.

Ao longo das últimas décadas, a cultura e a imagem ao vivo de câmaras de ovos de Drosophila , estruturas acinares semelhantes a órgãos primitivos, contribuiu imensamente para a compreensão dos princípios básicos do desenvolvimento de órgãos primitivos^{1 , 2. º , 3}. atualmente, existem vários protocolos de cultivo disponíveis, e seu uso depende do tempo de aquisição, tipo de célula a ser imaged, e sua acessibilidade (por exemplo, germline interior vs. linha somática externa)⁴.

Uma característica comum em todos estes protocolos de cultivo é a necessidade para a imobilização de câmaras de ovo analisadas que exibem uma atividade contrátil elevada nos meios líquidos. A atividade contrátil das câmaras de ovos é causada principalmente pela folha muscular que abrange uma longa seqüência de câmaras de ovo conectadas^5,6,7. Portanto, para conseguir a imobilização adequada das câmaras de ovo jovens, várias abordagens foram desenvolvidas, envolvendo a cobertura de câmaras de ovo com coberturas^6,8,9 ou cobertores flexíveis^{4, 10} ou encaixá-los em agarose de ponto de fusão baixa^3,11. Estas aproximações são populares porque igualmente permitem a imagem latente de um plano Visual maior devido ao aplainamento subtil da superfície circunferencial das câmaras de ovo.

Entretanto, recentemente, mostrou-se que as câmaras de ovo novas (estágio 1-8) giram em torno de seu eixo anterior-posterior⁶ e que este movimento do tecido está alimentado por uma rede fina do actomiosina perto da superfície circunferencial destas câmaras ^{de ovo novas 12}. portanto, a alteração artificial da superfície celular causada por um achatamento sutil deste tecido pode ter um impacto negativo sobre o comportamento da maquinaria de actomiosina geradora de força. O contraponto é que se o tecido da câmara do ovo não é aplainado, a imagem latente microscópica das proteínas na superfície circunferencial de câmaras de ovo torna-se ainda mais limitada pelo tamanho diminuído do plano da aquisição.

Por isso, combinámos protocolos de Prasad et al.⁹ e o laboratório de Celeste Berg^4,10 e modificou-os ainda mais para que não se utilizava lamínula/manta flexível/agarose no método desenvolvido. As câmaras do ovo de Drosophila são cultivadas livremente nos meios e o protocolo apresentado aqui aplica-se somente a microscopia invertida. Há duas partes no protocolo. A primeira parte é focada na análise de sinais de actomiosina na escala celular local (até 15 células) dentro das câmaras de ovo. Na segunda parte, focamos em superar as limitações associadas a um pequeno plano de aquisição causado pela livre cultivo de câmaras de ovos. A este respeito, desenvolvemos um novo método computacional baseado em Fiji com uma interface de usuário gráfica semiinterativa que extrai e desdobra seletivamente camadas definidas de uma superfície circunferencial do tecido. Isso é seguido por um protocolo que descreve como analisar a actomiosina na escala tecidual (i.e., > 50 células). Como a extração seletiva de uma camada fina definida de tecidos epiteliais curvados não foi facilmente possível usando uma projeção de pilha z clássica (Figura 1), este método Easy-to-use serve como um pré-requisito importante para compreender compreensivamente o comportamento de uma rede de actomiosina fina (< 1 μm) na escala tecidual em câmaras de ovos de Drosophila .

Além disso, para facilitar o protocolo, fornecemos exemplos de filmes de lapso de tempo (TLMs) e arquivos de amostra de comportamento de myosin II convencional sem músculo fluorescentamente marcados (ver arquivo complementar 3). Myosin II é uma proteína do motor e representa a parte contrátil ativa da maquinaria do actomiosina. Para a imagem de myosin II, utilizamos linhas de Drosophila transgênicas que contêm uma cadeia leve regulatória modificada de miosina II denominada mrlc:: GFP (ver tabela de materiais para detalhes)^12,13. A fim de visualizar as membranas celulares, o protocolo é baseado em corantes comerciais (ver tabela de materiais). Este protocolo é apropriado não somente para a análise de mrlc subcellular pequeno:: sinais de GFP¹² mas também para todas as partículas subcellular de tamanho semelhante em torno de ± 300 μm, tais como aquelas observadas com vida-ato:: GFP^12,14.

Embora ambos estes protocolos sejam apresentados usando in vitro as câmaras de ovo cultivadas da Drosophila , a aquisição de sinais do actomiosina podem igualmente ser executadas usando outros tecidos em cima da optimização dos meios cultivando e dependendo da disponibilidade de proteínas com marcas fluorescentamente marcadas com corantes comerciais correspondentes ou, por exemplo, microinjeções de mRNA para obter perfis transitórios de expressão gênica. Similarmente, o protocolo Fiji-baseado para a extração de uma camada fina de uma superfície circunferencial pode ser aplicado mais geralmente aos elipsóide e órgão-como tecidos.

Protocol

Nota: O protocolo a seguir fornece instruções sobre como analisar a actomiosina no celular local e a escala tecidual em câmaras de ovos de Drosophila . A abordagem em escala local permite aos usuários analisar o comportamento detalhado da actomiosina em até 15 células por câmara de ovo e requer a aquisição de TLMs por um curto período de tempo (5 – 10 min) usando imagens de alta velocidade e um microscópio confocal invertido. Ao contrário, a escala do tecido fornece usuários a informação do actomiosina em 50-100 pilhas e exige a aquisição de TLMS por um longo período de tempo (≥ 30 minutos) usando a imagem latente de baixa velocidade e um microscópio de giro invertido do disco (veja Figura 2 e parâmetros recomendados em cada escala na tabela 1). A decisão na qual a escala para analisar os sinais de actomiosina depende inteiramente da questão científica do usuário. Os TLMs de teste acompanhados devem ajudar a tomar esta decisão.

1. escala celular local (LCS)

Nota: Para dissecar e imagem in vitro cultivadas câmaras de ovo de Drosophila , siga o protocolo descrito em arquivo complementar 1. Para analisar os TLMs adquiridos, continue com o seguinte protocolo. Links para acompanhar arquivos de teste de TLMs são fornecidos no arquivo complementar 3.

1. Processamento de dados de TLMs na escala celular local (LCS)
   1. Correção de lixívia de TLMs para compensar a deterioração da intensidade de rótulos fluorescentes
      1. Certifique-se de que um aplicativo Fiji atualizado esteja instalado no computador que está sendo usado seguindo estas instruções: fiji > abra um TLM (por exemplo, TestMovie1. tif do arquivo complementar 3).
      2. Divida os canais de cores clicando em imagem > cor > canais divididos.
      3. Realize uma correção de lixívia em ambos os canais usando a imagem > ajustar ≫ correção de lixívia ≫ razão simples > intensidade de fundo 0,0.
         Nota: Se resultados insatisfatórios são obtidos, explorar quais os métodos de correção neste plugin se encaixa melhor (por exemplo, usar histograma correspondência em vez de uma relação simples).
   2. Segmentação de célula para gerar uma máscara de célula para TLMs
      1. Se Fiji ainda não estiver aberta, reabra-a (e certifique-se de que está atualizada) após a ajuda > atualização ≫ aplicar alterações > OK.
      2. Se isso ainda não tiver sido feito, baixe a macro Tissuecellsegmentmovie. IJM (de http://ADM.irbbarcelona.org/MATLAB/TissueCellSegmentMovie.IJM). Arraste e solte este script em Fiji.
      3. Abra o arquivo TLM. TIFF corrigido por lixívia (consulte a seção 1.1.1). Divida os canais do arquivo corrigido por lixívia usando a imagem > cor > canais divididos.
      4. Execute o script carregado no canal de membrana de célula ativa do TLM selecionado pressionando o ícone executar no script aberto. Defina o borrão Gaussian para 2,500 e a sensibilidade de detecção de célula para -1 e clique em OK. A fim de obter uma boa máscara celular, não altere esses parâmetros acima. Defina a tolerância de ruído estimada entre 10 – 20 para TLMs adquiridos com o objetivo 63x e clique em OK.
         Nota: Para outros objetivos, podem ser necessários diferentes parâmetros. O limpador de fundo em um TLM, a menor tolerância ao ruído estimado é necessária.
      5. Uma máscara gerada da pilha aparece no TLM analisado e igualmente em uma janela nova chamada Particlestack (G), e além, uma janela pequena chamada ação exigida aparece. Da máscara da pilha no TLM, concentre-se somente nas pilhas no centro do TLM e selecione aquelas que podem fornecer esboços completos e bem definidos durante todo o TLM.
      6. Se as células selecionadas contiverem contornos de células artificiais/extras, use a janela da ferramenta de mesclagem chamada ação necessária no TLM. Para este último, siga as instruções na janela.
         Nota: Certifique-se de que os contornos da célula estão bem definidos e correspondem às membranas celulares reais em um TLM, pois qualquer imprecisão pode impactar as análises subsequentes. Ajustes e alterações adicionais, como a remoção de células indesejadas, podem ser feitos posteriormente usando a ferramenta Gerenciador de superfície (descrita na seção 1.1.3).
      7. Quando as células selecionadas no centro correspondem bem às membranas celulares reais, salve ParticleStack como um arquivo. TIFF após o arquivo ≫ salvar como > TIFF.
   3. Carregamento da máscara de célula gerada no Gerenciador de superfície
      1. Instale o Surface Manager plugin¹⁵ na configuração de Fiji usada. Siga as instruções de Viktorinova et al.¹⁶.
      2. Abra o Surface Manager utilizando Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D).
         Nota: A janela do Gerenciador de superfície exibe vários botões de ação à direita e uma janela vazia à esquerda. Para ver todos os botões de ação, pode ser necessário esticar a janela em sua altura/largura. Observe que os prazos aparecerão como fatias z.
      3. Abra o arquivo ParticleStack. TIFF correspondente no Surface Manager clicando em arquivo > abrir e selecione a imagem para abrir (por exemplo, ParticlesStack1. tif).
      4. No Surface Manager, clique no botão ler imagem da estrutura de tópicos e defina o índice Jacquard para 60%.
         Nota: Carregar o arquivo ParticlesStack1. tif pode demorar até vários minutos, dependendo da potência de processamento do computador.
      5. Uma vez carregado, cada célula será atribuída com um número S e aparecerá na parte esquerda da janela do Surface Manager.
         Nota: Para mostrar contornos e nomes de célula para todas as células, marque as caixas de seleção Mostrar todas e Mostrar rótulos na parte inferior da janela do Gerenciador de superfície. Recomenda-se usar esta função uma vez que os números de pilha estiveram verificados para sua exatidão.
      6. Clique no primeiro número S; o contorno da célula importada de ParticlesStack1. tif aparece no TLM. Verifique cada número S importado para a qualidade do contorno da célula em todo o TLM e remova as células indesejadas que exibem contornos de célula incorretos. Para fazer isso, realce o contorno da célula e clique no botão delete.
         Nota: Também é possível corrigir os contornos das células imprecisas e adicionar novos contornos de células. Isso é descrito na seção de discussão.
      7. Salve todas as células corrigidas como um arquivo RoiSet. zip pressionando o botão salvar no disco .
         Nota: Se a sessão precisa ser interrompida, é possível carregar o arquivo RoiSet no Gerenciador de superfície mais tarde: Abra um TLM em Fiji (arquivo > abrir) e selecione um TLM. Abra o Gerenciador de superfície via Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D). Carregue o arquivo RoiSet. zip correspondente clicando no botão Load do disco e escolhendo o arquivo roiset. zip apropriado. Verifique se as máscaras de célula carregadas correspondem ao TLM carregado.
   4. Correção para tração tecidual em TLMs
      Nota: Durante o tempo de aquisição dos TLMs, os efeitos de deriva podem ser observados devido à rotação epitelial ou a um movimento indesejado. Em ambos os casos, nós recomendamos corrigir para toda a tração a fim simplificar a análise manual do actomiosina mais tarde. A correção de deriva é necessária apenas para a análise de actomiosina manual. Este tutorial requer software up-to-date de Fiji com o MultiStackReg plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) instalado.
      1. Abra o TLM lixívia-corrigido em Fiji através do arquivo > abrir e selecione o arquivo Bleach-corrigido criado usando o tutorial mencionado acima.
      2. Divida os canais e selecione aquele que identifica as membranas celulares através da imagem > cor > canais divididos.
      3. Use o seguinte protocolo quando os contornos da célula não são visivelmente suaves: processo > filtros ≫ borrão Gaussian. Defina-o como ~ 1 – 2 para um objetivo de 63x e clique em OK e então Sim. Clique em processar > binário > converter para mascarar usando as configurações padrão; em seguida, clique em OK.
      4. Carregar o plugin MultiStackReg seguintes Plugins > Registration > multistackreg.
      5. Certifique-se de que a pilha 1 está definida para o canal de membrana da célula, ação 1 é definida como alinhar e transformação é definida como tradução. Marque a caixa de seleção salvar arquivo de transformação e clique em OK.
      6. Reabra o TLM selecionado, o plug-in MultiStackReg e o arquivo de transformação salvo usando o arquivo > abrir e selecione um TLM. Divida os canais de cores usando a imagem > cor > canais divididos.
      7. Carregue o plugin MultiStackReg clicando em Plugins > Registration > multistackreg. Selecione carregar arquivo de transformação como ação 1.
      8. Deixe a transformação como corpo rígido e clique em OK. Selecione o arquivo de transformação salvo anteriormente e clique em OK novamente.
      9. Mesclar os canais de imagem e salvar o TLM registrado como um arquivo. TIFF após a imagem > cor > mesclar canais. Salve o arquivo clicando em arquivo ≫ salvar como > TIFF.
         Nota: Existem maneiras alternativas para corrigir uma deriva de tecido em Fiji, ou seja, através de Plugins > registro > Stackreg/desvio 3D correto.
2. Análise de pulsos de actomiosina no gerente de superfície da LCS
   Nota: Esta etapa do protocolo permite que os cientistas identifiquem se os pulsos do actomiosina estão atuais no tecido analisado e para compreender o comportamento detalhado assim como a direcionalidade de sinais do actomiosina.
   1. Abra Fiji e assegure-se de que um TLM e sua máscara de célula correspondente estejam abertos no Gerenciador de superfície.
      Nota: Assegure-se de que Fiji esteja instalado e atualizado e que o plugin do Surface Manager esteja instalado (etapa 1.1.3.1).
   2. Abra um TLM com arquivo > abrir e selecione um TLM para abrir (por exemplo, TestMovie1_bleach. tif). Carregar o Gerenciador de superfície plugin via Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D). Carregar a máscara de célula salva criada no tutorial aqui (por exemplo, ParticlesStack1. tif) via arquivo > abrir e selecione uma máscara de célula (por exemplo, ParticlesStack1. tif). Carregue a região de interesse correspondente (ROI, por exemplo, TestMovie1_RoiSet. zip). Consulte a Figura 3a.
   3. Mude para o canal de interesse no TLM seleccionado.
      Nota: Para distinguir os canais, siga o código de cores indicado em torno do TLM.
   4. No Surface Manager, clique no botão estatísticas para obter a janela denominada valor cinzento médio fatia por fatia (Figura 3B). Note-se que os valores de intensidade média/mediana dos sinais de actomiosina em um determinado canal analisado dentro dos contornos das células definidas ao longo do tempo serão exibidos, bem como outros parâmetros relacionados à área celular e à forma celular.
      Nota: Os valores de intensidade estão em unidades de arbitraty (U.A.); a área da célula está em pixels e precisa ser convertido em micrômetros quadrados.
   5. Salve os valores obtidos como um arquivo de planilha. Clique na janela estatísticas, arquivo ≫ salvar como.
      Nota: É possível verificar os valores estatísticos obtidos mais tarde como segue: Abra o TLM lixívia-corrigido em Fiji e abra o gerente de superfície. Carregue o RoiSet. zip correspondente ao TLM pressionando o botão Load do disco e abra o arquivo. A máscara salva com contornos de célula será carregada e os nomes das células aparecerá na janela do Gerenciador de superfície à esquerda. Clique no botão estatísticas para valores estatísticos.
3. Análise manual de sinais de actomiosina subcelular individuais na LCS
   Nota: Este protocolo exige a maioria de concentração e é demorado. Em geral, um TLM adquirido pode ser confortavelmente analisado dentro de 1 dia. Isto não inclui o tempo para a preparação da mosca antes de sua dissecção, a dissecção própria, e a aquisição da imagem.
   1. Abra um TLM selecionado, lixívia-corrigido e registrado (drift-corrigido) em uma aplicação up-to-date de Fiji. Use uma TLM corrigida por lixívia e corrigida por deriva (por exemplo, TestMovie1_bleach_reg. tif) como exemplo de teste.
   2. Ajuste o brilho e o contraste para ver os sinais de actomiosina individuais usando a imagem > ajustar > brilho/contraste.
   3. Alinhe os TLMs na mesma direção em relação ao eixo do tecido/corpo. No caso das câmaras de ovo, alinhe o lado anterior das câmaras de ovo sempre à esquerda da imagem/subfilme/TLM antes da análise.
   4. Divida o filme selecionado em curtas 30 s submovies e time-Project cada um deles. Salve SubFilmes projetados em tempo não projetado e projetados por tempo com nomes correspondentes. Mantenha a fonte original.
      Nota: Os SubFilmes podem ser criados a partir de TLMs originais pela primeira exclusão de quadros indesejados via Image > Stacks > Slice remover. Defina as fatias a serem removidas e defina incremento. Transforme em RGB antes de usar o removedor de fatia quando Increment = 1. Para projetar um subfilme de 30 s, clique em imagem > Stacks > Z-Project > intensidade máxima para os quadros definidos (fatias) e, em seguida, clique em OK. Pule cada segundo subfilme de 30 s, a fim de evitar a contagem de sinais de actomiosina 2x em dois SubFilmes 30 s subsequentes.
   5. Coloque uma imagem projetada para o tempo ao lado do subfilme correspondente de 30 s (figura 4a, B). Identifique a linha de sinal no subfilme projectado pelo tempo. Identifique a direção do movimento do sinal de actomiosina (0 ° – 360 °) ao longo desta linha no subfilme original ao reproduzir manualmente o subfilme. Use a ferramenta Angle (na barra de Fiji) para medir manualmente a direção do movimento do sinal em relação ao eixo do tecido definido ou a uma ferramenta disponível semelhante.
      Nota: Fiji só funciona em uma escala de 0 ° – 180 ° (Figura 4C), e um recálculo dos valores obtidos para uma escala de 0 ° – 360 ° é necessário. Uma linha de sinal corresponde à trajetória de um movimento de sinal de actomiosina ao longo do tempo.
   6. Para evitar a duplicação na análise dos sinais de actomiosina, marque as linhas de sinal analisadas dentro das células no subfilme projectado pelo tempo (Figura 4B, D).
   7. Analise todas as células selecionadas no subfilme de 30 s e salve os ângulos obtidos.
      Nota: Analise somente sinais citoplasmáticos subcelulares do actomiosina nas pilhas com os esboços bem definidos da pilha durante todo um TLM. Exclua células individuais com menos de 15 – 20 sinais detectados em todo o TLM. Ignore sinais de actomiosina que se movem através de células devido à sua origem desconhecida. Um exemplo de contagem de sinais para uma célula analisada no subfilme de 30 s é mostrado na Figura 4D.
   8. Continue até que todos os 30 s-Long submovies de um TLM são analisados, e salvar todos os ângulos medidos de sinais de actomiosina de um TLM em um arquivo de planilha.
   9. Resumir todos os ângulos medidos sobre o número relevante de TLMs (dependente do experimento). Plotar a porcentagem da direção dos sinais de actomiosina analisados, por exemplo, como um diagrama de rosa com um intervalo de 0 ° a 360 ° com um software preferencial.
      Nota: Para se obter resultados estatisticamente significantes, recomenda-se a análise de cinco a dez câmaras de ovos independentes de qualquer fase da câmara de ovos.

2. escala do tecido

Nota: Para dissecar e imagem in vitro cultivadas câmaras de ovo de Drosophila , siga o protocolo em arquivo complementar 2. Para analisar os TLMs adquiridos, continue com o seguinte protocolo abaixo. Os arquivos de teste acompanhados de TLMs são colocados no arquivo complementar 3.

1. Extração seletiva de superfície de tecidos epiteliais curvados
   Nota:Este protocolo permite que os usuários extraem seletivamente uma camada fina de actomiosina em um tecido epithelial curvado sobre o tempo. Esta etapa de protocolo é fácil de usar e baseada em uma interface gráfica intuitiva. É possível analisar confortavelmente (superfície do extrato) vários TLMs. Use TestMovie2. CZI (doArquivo complementar 3) como um exemplo TLM de teste.
   1. Abra um aplicativo up-to-date Fiji (fiji > ajuda ≫ Atualizar > aplicar alterações > OK).
   2. Assegure-se de que o plugin de projeção de superfície Ellipsoid¹⁵ esteja instalado. Seguir Viktorinova et al. a ¹⁶.
   3. Abra um TLM e exportá-lo como um arquivo XML/HDF5 clicando em Plugins ≫ bigdataviewer > Exportar imagem atual como arquivo XML/HDF5.
      Nota: É necessário definir um caminho de exportação. A poupança em si pode demorar vários minutos e depende do comprimento TLM.
   4. Abra o arquivo exportado na projeção de superfície Ellipsoid clicando em Plugins ≫ bigdataviewer ≫ projeção de superfície ELIPSÓIDE > Selecionar arquivo XML.
      Nota: Uma nova janela com vistas sagitais da câmara de ovo e uma caixa de diálogo para guiar o usuário através do processamento aparecerá. Detalhes sobre como navegar na vista de fatia podem ser encontrados em https://imagej.net/BigDataViewer.
   5. A janela de diálogo chamada projeção de ovários tem várias abas. Na primeira guia de diálogo chamada caixa delimitadora, defina as bordas x e y de uma câmara de ovo no TLM juntamente com a largura z da caixa delimitadora (ou seja, a profundidade de uma pilha z/câmara de ovo) e pressione set (Figura 5a).
   6. Para definir bordas, arraste os botões ao lado de x, y e z ou defina as coordenadas numéricas nas caixas x, y e z. Assegure-se de que as beiras sejam generosas bastante para começ a parte da câmara de ovo do interesse na extração de superfície. As partes selecionadas da câmara de ovo são destacadas em rosa.
   7. Alterne para a guia chamada Localizar BLOBs na janela Ovaria projeção. Defina o Sigma e o valor mínimo de pico; em seguida, pressione COMPUTE para identificar os sinais de actomiosina (Figura 5b), que aparecerá como BLOBs verdes. Repita esta etapa com parâmetros diferentes até que pontos suficientes (cerca de 100) sejam encontrados.
      Nota: Sigma 1 \ u20123 com valor mínimo de pico 20 \ u2012100 funciona o melhor para identificar sinais de actomiosina de Stage-6 para-8 câmaras de ovo. A identificação de sinais de actomiosina é um passo crucial e depende da qualidade do sinal e do seu tamanho. É importante confirmar o tamanho correto dos BLOBs existentes. Nenhuma mancha verde visível/BLOBs na imagem significa que a próxima etapa não funcionará. Navegue pelos planos z selecionados para ver os BLOBs.
   8. Para projetar o elipsóide, continue com a guia chamada elipsóide de ajuste. Defina amostras aleatórias para 10.000, fora/dentro da distância de corte para 1 \ u201210 e, em seguida, clique em Compute (Figura 5C).
      Nota: Quanto menor a distância de corte, mais precisa será o elipsóide desejado. Depois disso, a guia chamada projeção abrirá automaticamente e permite a definição da extração de superfície. As configurações precisam ser otimizadas.
   9. Continue com a guia chamada projeção (Figura 5D). Configure uma distância de projeção mínima e máxima (ou seja, a largura do elipsóide desejado). É necessário definir uma distância de projeção mínima e máxima para que a região elipsóide definida por rosa inclua toda a camada externa da câmara de ovo. Defina a distância da fatia (1 é recomendado).
      Nota: Exemplos de um ajuste elipsóide incorreto e ótimo, resultando em parâmetros de projeção incorretos e ideais são mostrados na figura 6A, C. A camada circunferencial fina do interesse pode ser definida mais tarde. Certifique-se de que a região rosa do elipsóide com a largura definida na câmara de ovo seja visível antes de pressionar a computação. É importante que o elipsóide desejado (linha única rosa) caiba bem a superfície elipsóide de uma câmara de ovo, a fim de obter os melhores resultados. Se o ajuste elipsóide não for bom, organize configurações diferentes até que a extração de superfície desejada seja obtida.
      1. Defina uma largura de saída (≥ 800) e altura (≥ 400) do elipsóide. Definir a partir da qual ponto de hora a que ponto de tempo a extração de superfície deve ser criada (ou seja, definir o comprimento da extração TLM). Escolha uma projeção esférica ou cilíndrica. Flip Z e alinhar Y se necessário.
      2. Pressione COMPUTE para obter uma extração de superfície para ambos os canais em novas janelas chamadas Image. Ajuste o brilho e o contraste das janelas de imagem obtidas para poder ver os sinais de actomiosina projetados, clicando em imagem > ajustar > brilho/contraste.
         Nota: Uma comparação de exemplo de uma projeção resultante de um ajuste elipsóide incorreto e ideal é mostrada na Figura 6B, D.
   10. Se a extração de superfície parece boa, salve as imagens (ambos os canais separadamente) como. TIFF. Além disso, salve o arquivo de janela de log para referência futura sobre como a superfície desta câmara de ovo em particular foi extraída.
       Nota: Esta é uma informação particularmente importante se a camada fina extraída deve ser devolvida à sua forma original desdobrada (apenas para programadores).
   11. Mesclar os canais com um código de cores preferido em Fiji.
       Nota: Se necessário, projese camadas z-Stack selecionadas com sinais de actomiosina. A projeção de camadas z-Stack selecionadas é necessária quando o foco de aquisição muda ligeiramente ao longo do tempo em um TLM. Para obter melhores resultados, projelhe no máximo uma a duas camadas de pilha z.
   12. Salve os resultados como arquivos. TIFF.
       Nota: Exemplos representativos de camadas finas (superfície basal e apical seletiva) que representam o sinal de myosin II (MRLC:: GFP) do epitélio folículo do controle e das câmaras de ovos mutantes corporal2 podem ser encontrados na Figura 8.
2. Processamento de dados de uma superfície de tecido selectivamente extraída
   1. Bleach-corrija os TLMs para compensar a deterioração da intensidade das etiquetas fluorescentes.
      1. Abra Fiji. Abra um TLM (por exemplo, TestMovie2_extraction. tif do arquivo complementar 3) usando o arquivo > abrir. Selecione a imagem para abri-la.
      2. Divida os canais de cores e converta-os em imagens de 16 bits, se necessário, clicando em imagem > cor > canais divididos. Converta os canais em imagens de 16 bits (de imagens de 32 bits) usando o tipo Image > > 16 bits.
      3. Realize uma correção de lixívia em ambos os canais usando a imagem > ajustar ≫ correção de lixívia ≫ razão simples > intensidade de fundo 0,0.
         Nota: Se resultados insatisfatórios são obtidos, é necessário para explorar quais os métodos de correção neste plugin melhor ajuste (por exemplo, usar histograma Matching em vez de uma relação simples).
      4. Mesclar os canais das duas imagens corrigidas por lixívia clicando em imagem > cor > mesclar canais. Salve a imagem mesclada como um arquivo. TIFF clicando em arquivo ≫ salvar como > TIFF.
         Nota: Ajuste o contraste e o brilho dos canais, se necessário.
   2. Segmentação de célula para gerar uma máscara de célula para TLMs
      1. Se Fiji ainda não estiver aberta, reabra-a (e certifique-se de que está atualizada clicando em ajuda > Atualizar ≫ aplicar alterações > OK).
      2. Se isso ainda não estiver feito, baixe a macro TissueCellSegmentMovie. IJM (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm).
      3. Arraste e solte este script em Fiji. Abra o arquivo corrigido de lixívia (por exemplo, TestMovie2_bleach. tif do arquivo complementar 3, consulte também 2.2.1).
      4. Divida os canais do arquivo corrigido por lixívia clicando na imagem > cor > canais divididos. Ajuste o canal de membrana para garantir contornos de células claras clicando em imagem > ajustar > brilho/contraste.
      5. Execute o script carregado no canal de membrana de célula ativa do TLM selecionado pressionando o ícone executar no script aberto. Defina Gaussian Blur para 1,500. Defina a sensibilidade de detecção de célula como-1 e clique em OK. Defina a tolerância ao ruído estimada para ~ 8 para TLMS adquiridos com o objetivo de 40x e clique em OK.
         Nota: A fim de obter uma boa máscara celular, não altere esses parâmetros acima. Para outros objetivos, podem ser necessários diferentes parâmetros. O limpador de fundo em um TLM, a menor tolerância ao ruído estimado é necessária.
      6. Uma máscara de célula gerada aparece no TLM analisado e também em uma nova janela chamada Particlestack (G). Além disso, uma pequena janela chamada ação necessária aparece. Da máscara da pilha no TLM, concentre-se somente nas pilhas no centro do TLM e selecione aquelas que podem fornecer esboços completos e bem definidos durante todo o TLM.
      7. Se as células selecionadas contiverem contornos de células artificiais/extras, use a janela da ferramenta de mesclagem chamada Action necessária no TLM. Para este último, siga as instruções na janela.
         Nota: Certifique-se de que os contornos da célula estão bem definidos e correspondem às membranas celulares reais em um TLM, pois qualquer imprecisão pode impactar as análises subsequentes. Ajustes e alterações adicionais, como a remoção de células indesejadas, podem ser feitos posteriormente usando a ferramenta Gerenciador de superfície (descrita no tutorial abaixo).
      8. Quando as células selecionadas no centro correspondem bem às membranas celulares reais, salve o ParticleStack como um arquivo. TIFF após o arquivo ≫ salvar como > TIFF. Prossiga para executar o carregamento da máscara de célula gerada e a análise de actomiosina no Surface Manager como anteriormente realizada nas secções 1.1.3 e 1,2 (também descrita em pormenor nas secções 2.2.3 e 2,3).
   3. Carregamento da máscara de célula gerada no Gerenciador de superfície
      1. Se o plug-in do Surface Manager já estiver instalado na configuração de Fiji utilizada, avance para o passo 2. Se não, siga Viktorinova et al.¹⁶. Para os desenvolvedores, apenas o código-fonte também está disponível¹⁵.
      2. Abra o Surface Manager clicando em Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D).
         Nota: A janela do Gerenciador de superfície exibe vários botões de ação à direita e uma janela vazia à esquerda. Para ver todos os botões de ação, pode ser necessário esticar a janela em sua altura/largura. Observe que os prazos aparecerão como fatias z.
      3. Abra o arquivo ParticleStack. tif correspondente no Surface Manager via arquivo > abrir e selecione a imagem para abrir (por exemplo, ParticleStack2. tif do arquivo complementar 3).
      4. No Surface Manager, clique no botão ler imagem da estrutura de tópicos e defina o índice Jacquard para 60%.
         Nota: Carregando um arquivo ParticleStack. tif pode demorar até vários minutos, dependendo da energia do computador.
      5. Uma vez carregado, cada célula será atribuída com um número S e aparecerá na parte esquerda da janela do Surface Manager (Figura 7a).
         Nota: Para mostrar contornos e nomes de célula para todas as células, marque as caixas de seleção Mostrar todas e Mostrar rótulos na parte inferior da janela do Gerenciador de superfície. Recomenda-se usar esta função uma vez que os números de pilha estiveram verificados para sua exatidão.
      6. Clique no primeiro número S; o contorno da célula importada de ParticleStack. tif aparece no TLM. Verifique cada número S importado para a qualidade do contorno da célula em todo o TLM e remova as células indesejadas que exibem contornos de célula incorretos. Para fazer isso, realce o contorno da célula e clique no botão delete.
         Nota: Também é possível corrigir os contornos das células imprecisas e adicionar novos contornos de células. Isso é descrito na seção de discussão.
      7. Salve todas as células corrigidas como um arquivo RoiSet. zip pressionando o botão salvar no disco .
         Nota: Se a sessão precisa ser interrompida, é possível carregar o arquivo RoiSet. zip no Surface Manager mais tarde: Abra um TLM em Fiji via arquivo > abrir e selecione um TLM. Abra o Gerenciador de superfície da seguinte maneira: Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D). Carregue o RoiSet. zip correspondente clicando no botão Load do disco e escolhendo o arquivo RoiSet. zip apropriado (por exemplo, TestMovie2_RoiSet. zip). Verifique se as máscaras de célula carregadas correspondem ao TLM carregado.
3. Análise de pulsos de actomiosina no Surface Manager
   Nota: Abra Fiji e assegure-se de que um TLM e sua máscara de célula correspondente estejam abertos no Gerenciador de superfície. Assegure-se de que Fiji esteja instalado e atualizado e que o Surface Manager plugin (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) esteja instalado.
   1. Abra um TLM com arquivo > abrir e selecione um TLM para abrir (por exemplo, TestMovie2_bleach. tif). Carregue o plugin do Surface Manager através de Plugins > segmentação ≫ Surface Manager (3D). Carregar a máscara de célula salva criada no tutorial aqui (por exemplo, ParticlesStack2. tif) via arquivo > abrir e selecione uma máscara de célula (por exemplo, ParticlesStack2. tif). Carregue o ROI correspondente (por exemplo, TestMovie2_RoiSet. zip).
   2. Mude para o canal de interesse no TLM seleccionado.
      Nota: Para distinguir entre os canais, siga o código de cores indicado em torno do TLM.
   3. No gestor de superfície, clique no botão estatísticas para obter a janela denominada valor cinzento médio fatia por fatia (Figura 7B). Note-se que os valores de intensidade média/mediana dos sinais de actomiosina em um determinado canal analisado dentro dos contornos das células definidas ao longo do tempo serão exibidos, bem como outros parâmetros relacionados à área celular e à forma celular.
      Nota: Os valores de intensidade estão em U.A.; a área da célula está em pixels e precisa ser convertido em micrômetros quadrados.
   4. Salvar os valores obtidos como um arquivo de planilha: clique na janela estatísticas, arquivo ≫ salvar como.
      Nota: É possível verificar os valores estatísticos obtidos posteriormente, como se segue. Abra a TLM corrigida com lixívia em Fiji. Abra o Gerenciador de superfície. Carregue o RoiSet. zip correspondente ao TLM pressionando o botão Load do disco e abra o arquivo. A máscara salva com contornos de célula será carregada e os nomes das células aparecerá na janela do Gerenciador de superfície à esquerda. Clique no botão estatísticas para valores estatísticos.
      Nota: Em relação a uma análise manual de sinais de actomiosina subcelular individuais, não é possível realizar uma análise manual dos sinais de actomiosina subcelular na escala tecidual. A otimização é necessária para a análise de sinais de actomiosina individuais na escala semitecidual, como destacado na seção de discussão.

Representative Results

Este protocolo permite que os cientistas investiguem o comportamento das redes de actomiosina nos tecidos epiteliais. Isso só é possível quando uma análise detalhada do comportamento da actomiosina na escala celular local (algumas células) é combinada com uma análise semelhante na escala tecidual (muitas células). No entanto, os tecidos epiteliais são frequentemente curvados e a extração de uma fina camada desses tecidos não foi antes facilmente possível, como mostrado nas câmaras de ovos de Drosophila (Figura 1). O protocolo aqui apresentado fornece aos usuários instruções simples que descrevem como analisar o comportamento da actomiosina nessas duas escalas (Figura 2).

A primeira parte deste protocolo concentra-se em instruções sobre a análise de pulsos de actomiosina usando o plugin do Surface Manager (Figura 3). Também descreve como analisar manualmente o comportamento individual da actomiosina na escala celular local (Figura 4). A segunda parte deste protocolo explica como extrair uma fina camada de tecido epitelial usando o plugin de projeção de superfície Ellipsoid (Figura 5 e Figura 6). Só então é possível analisar pulsos de actomiosina na escala de tecido usando o plugin do Surface Manager (Figura 7). Os resultados representativos e uma comparação do comportamento da actomiosina no controlo rotativo e nas câmaras de ovo de Drosophila corporal2 mutantes estáticas na escala celular e tecidual local são mostrados na Figura 8 e no filme correspondente 1, Movie 2, Movie 3, Movie 4, Movie 5e Movie 6 (para obter detalhes, consulte a Figura 8).

Figura 1: extração seletiva de uma camada fina de uma superfície curvada do tecido. (A) a fim de obter informações suficientes sobre as redes de actomiosina em epithelia circunferencial curvada, é necessário adquirir uma pilha z profunda (rosa) sobre a maioria de um tecido visível, como mostrado para o epitélio do folículo curvo (cinza) de câmaras de ovos de Drosophila . (A ') Entretanto, uma projeção simples de tal z-pilha conduz à mistura de redes inteiras do actomiosina em pilhas do folículo. Myosin II visualizado com MRLC:: GFP (verde) mostra a fortemente expressando a região (apical) interna de pilhas do folículo em tal z-projeção e quase nenhuma informação do lado (exterior) basal, onde myosin II indica um phenotype planar forte da polaridade da pilha, mas seu intensidade do sinal é baixa¹². Para evitar tal mistura como mostrado no painel a ', temos desenvolvido um usuário-amigável, Fiji-based plugin chamado Ellipsoid superfície projeção em bigdataviewer¹⁸ que permite (B) a extração seletiva de uma camada definida, fina (rosa ) de actomiosina a partir de um epitélio curvo (B '), como mostrado para MYOSIN II (verde) em uma extração selecionada do lado basal (exterior) do epitélio folículo. Compare a diferença no sinal de myosin II (MRLC:: GFP) nos painéis A ' e B '. Observe o padrão polarizado planar de myosin II no painel B '. Os contornos da célula estão em vermelho. O lado anterior está à esquerda. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: rede de actomiosina polarizada planar nas escalas celulares e teciduais locais. A imagem latente da actomiosina em escalas diferentes permite a análise de números diferentes de pilhas epithelial, a saber (a) até 15 pilhas na escala celular local e (B) 50-100 pilhas na escala do tecido no epitélio do folículo de cultivado Câmaras de ovos de Drosophila. A miosina II não-muscular é visualizada com MRLC:: GFP (verde) e o genótipo da linha transgênica utilizada é especificado na tabela de materiais. Os contornos da célula estão em magenta. O lado anterior está à esquerda. Barras de escala = 5 μm (A); 50 μm (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: um exemplo da análise de pulsos de myosin II no gerente de superfície na escala celular local. (A) uma pilha de partículas é carregada no Gerenciador de superfície. Observe que todas as células identificadas no TLM aparecem na janela do Gerenciador de superfície. É importante excluir todas as células indesejadas ou incompletas ao longo de um TLM. (B) as estatísticas obtidas em MYOSIN II (mrlc:: GFP) para as células selecionadas são mostradas na janela chamada valor de cinza médio fatia por fatia no Gerenciador de superfície. MRLC:: GFP é mostrado em verde, enquanto as membranas celulares estão em vermelho. O lado anterior está à esquerda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: um exemplo da análise manual de sinais individuais de myosin II na escala celular local. (A) um subfilme selecionado de 30 s-Long é colocado ao lado de (B) sua projeção de tempo. Observe que, após a projeção de tempo, myosin II (MRLC:: GFP) mostra linhas de trajetória mais longas (ver painel B) dentro de células individuais do que em um período de tempo individual (ver painel A). As linhas individuais nas células devem ser analisadas para sua direção angular em relação ao eixo ântero-posterior das câmaras de ovos. (C) Observe que Fiji não mede 0 ° – 360 °, mas apenas 0 ° – 180 ° para sinais apontando para cima e 0 ° – 179 ° para sinais apontando para baixo. Esteja ciente de que 0 ° é atipicamente colocado à direita de uma imagem analisada. (D) com base nessas informações, as linhas que se movem com (em rosa) ou contra (em amarelo) a direção da rotação epitelial em uma câmara de ovo em particular devem ser Binned para identificar se a quebra de simetria dos sinais analisados está presente dentro de um célula e, em seguida, para múltiplas células no tecido analisado. MRLC:: GFP é mostrado em verde, enquanto as membranas celulares estão em vermelho. O lado anterior está à esquerda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: um exemplo de gerar um ajuste elipsóide na escala de tecido. A fim de caber um elipsóide em uma câmara de ovo usando o plugin de projeção de superfície elipsóide no bigdataviewer, é necessário definir (a) uma caixa delimitadora que inclua a maioria do tecido digitalizado. Em seguida, é importante (B) identificar pontos de sinal, que são um pré-requisito para uma geração de ajuste elipsóide ideal. (C) quando o ajuste elipsóide não é ideal e não cercar bem uma câmara de ovo, isso resulta em (D) extração de camada de tecido pobre. Veja a extração e a projeção posterior resulta na Figura 6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: comparação de um ajuste elipsóide incorreto e ideal e projeções de superfície correspondentes. (A) quando o elipsóide não é cabido corretamente, (B) a projeção de superfície final não fornecerá dados de sinal completos na camada fina do tecido analisado. (C) no entanto, quando equipado de forma otimizada, garante uma detecção de sinal igual de uma camada fina no tecido. (D) Observe que a projeção de superfície ideal contém várias camadas finas como uma pilha zprojetada por superfície ao longo do tempo, que pode ser separada subseqüentemente, conforme mostrado na Figura 8. Sinais de miosina II (MRLC:: GFP, branco) e sinais de membrana (branco) são inicialmente fundidos antes da projeção (painéis a e C), mas sobre a projeção de superfície propriamente dita, estes canais são separados (ver projeções de myosin II nos painéis B e D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: um exemplo da análise de pulsos de myosin II no gerente de superfície na escala de tecido. (A) uma pilha de partículas é carregada no Gerenciador de superfície. Observe que todas as células identificadas no TLM aparecem na janela do Gerenciador de superfície. É importante excluir todas as células indesejadas ou incompletas ao longo de um TLM. (B) as estatísticas obtidas em pulsos de MIOSINA II (mrlc:: GFP) (média ou mediana) para as células selecionadas ao longo do tempo são mostradas na janela chamada fatia de valor cinza média por fatia no Gerenciador de superfície. Note que os pontos mais fortes da miosina II podem influenciar a medida final da intensidade intrínseca da miosina II. Isso resulta do problema que esses pontos myosin II podem aparecer para migrar além do contorno de célula onde há uma definição de estrutura de tópicos de célula incorreta na máscara de célula gerada. MRLC:: GFP é mostrado em verde, enquanto as membranas celulares estão em vermelho. O lado anterior está no topo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Resultados representativos de uma rede de myosin II no epitélio do folículo de Drosophila . Exemplos representativos do comportamento dinâmico de myosin II (mrlc:: GFP) (a e B) na escala celular local e (C-F) na escala do tecido para o controle e corporal2 as câmaras do ovo da Drosophila do mutante. Consulte tabela de materiais para obter informações detalhadas sobre os genótipos usados. Observe que MRLC:: sinais GFP (verde) movem perpendiculares ao eixo anterior-posterior (AP) das câmaras de controle do ovo. Esta polaridade é perdida nas câmaras do ovo do mutante corporal2 e conduz aos pulsos/oscilações anisotrópica de myosin II¹². Em cima da análise manual de MRLC pequeno:: sinais de GFP (~ 300 μm) e a quantificação de seu movimento direcional angular como descrito no protocolo, quebrando da simetria de MRLC:: os sinais de GFP podem ser observados com uma preferência de encontro à direção do epitélio a rotação em uma câmara de ovo analisada¹² (Figura 4). Os filmes correspondentes são: painel A = filme 1, painel B = filme 2, Painel C = filme 3, painel D = filme 4, painel e = filme 5, e painel F = Filme 6. Os contornos das células são mostrados em magenta. O lado anterior está à esquerda. Barras de escala = 5 μm (A e B) e 50 μm (C-F). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Parâmetros recomendados para imagens de alta velocidade de curto prazo na escala celular local:
Eu.	Tecido de interesse livremente colocado no meio de cultivo (ou seja, sem deslizamentos de cobertura, cobertores flexíveis, etc.)
Ii.	objetivo da água 63x com abertura numérica > = 1,3
Iii.	Microscópio confocal invertido
Iv.	Único plano
V.	intervalos de tempo de 6-12 s
vi.	5-10 minutos TLMs
Vii.	Requisito de armazenamento de dados por TLM até 100MB
Parâmetros recomendados para imagens de baixa velocidade de longa duração na escala de tecido:
Eu.	Tecido de interesse livremente colocado no meio de cultivo (ou seja, sem deslizamentos de cobertura, cobertores flexíveis, etc.)
Ii.	objetivos da água 40x e abertura numérica > = 1,3
Iii.	Microscópio de disco giratório invertido
Iv.	z-Stacks para adquirir CA. metade de uma câmara de ovo
V.	intervalos de tempo de 60 s
vi.	Pelo menos 30 minutos TLMs
Vii.	Requisito de armazenamento de dados ca. 1GB

Tabela 1: parâmetros de imagem recomendados.

Filme 1: comportamento dinâmico representativo de myosin II (MRLC:: GFP) na escala celular em uma câmara de ovo de Drosophila de controle. Note que MRLC:: GFP (verde) prefere mover perpendicular ao eixo AP das câmaras de ovo. Os contornos das células estão em magenta. Vista basal. O lado anterior está à esquerda. Barra de escala = 5 μm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Clique com o botão direito do mouse para baixar.

Filme 2: comportamento dinâmico representativo de myosin II (MRLC:: GFP) na escala celular em uma câmara do ovo da Drosophila do mutante corporal2 . Observe que MRLC:: GFP pulsos (verde) e não é mais planar alinhado perpendicular ao eixo AP de câmaras de ovo estático. Os contornos das células estão em magenta. Vista basal. O lado anterior está à esquerda. Barra de escala = 5 μm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Clique com o botão direito do mouse para baixar.

Filme 3: comportamento dinâmico representativo da miosina II basal (MRLC:: GFP) na escala do tecido em uma câmara do ovo da Drosophila do controle. Note-se que apenas uma fina basal (exterior) MRLC:: GFP camada é extraída a partir de quase metade do epitélio folículo de uma câmara de ovo. MRLC:: GFP está em verde e células contornos estão em magenta. Observe a diferença no nível de detalhe do MRLC obtido:: o comportamento do sinal GFP aqui (representando a escala do tecido) em comparação com o filme 1 (representando a escala celular). O lado anterior está à esquerda. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Clique com o botão direito do mouse para baixar.

Filme 4: Comportamento dinâmico representativo do myosin básico II (MRLC:: GFP) na escala do tecido em uma câmara de ovo da Drosophila do mutante corporal2 . Note-se que MRLC:: GFP (verde) pulsos fortemente no lado basal de quase metade do epitélio folículo de uma câmara de ovo mutante corporal2 e não consegue gerar a força sincronizada necessária para promover a rotação epitelial. Os contornos das células estão em magenta. O lado anterior está à esquerda. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Clique com o botão direito do mouse para baixar.

Filme 5: Comportamento dinâmico representativo do myosin APICAL II (MRLC:: GFP) na escala do tecido em uma câmara do ovo da Drosophila do controle. Apenas uma camada fina de MRLC:: GFP é extraída do lado apical (interno) de quase metade do epitélio folículo de uma câmara de ovo. Note-se que MRLC:: GFP (em verde) mostra comportamento dinâmico diferente aqui no lado apical, em comparação com o lado basal do epitélio folículo (como mostrado no filme 3). Os contornos das células estão em magenta. O lado anterior está à esquerda. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Clique com o botão direito do mouse para baixar.

Filme 6: comportamento dinâmico representativo da miosina II apical (MRLC:: GFP) na escala do tecido em uma câmara de ovo do Drosophila do mutante corporal2 . Comportamento dinâmico alterado de MRLC:: GFP (verde) extraído de uma região apical fina de quase metade do epitélio folículo de uma câmara estática do ovo do mutante de corporal2 . Os contornos das células estão em magenta. O lado anterior está à esquerda. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver este vídeo. Clique com o botão direito do mouse para baixar.

Discussion

Etapas críticas e solução de problemas para a dissecação e cultivo de câmaras de ovo

Se muitas moscas são colocadas em um pequeno frasco, o alimento mosca pode virar lamacento após 2 – 3 dias devido a grandes quantidades de larvas de alimentação e moscas adultas ficando presos no alimento mosca. Nesse caso, vire o resto dessas moscas em um novo frasco com alimentos frescos e reduzir seu número. Em particular, excluir as fêmeas que estavam presas na comida.

A mistura de Schneider (SM) deve ser preparada com antecedência e pode ser armazenada a 4 ° c durante ~ 14 dias. Esteja ciente de que uma mistura mais velha pode conter cristais que podem danificar a superfície das câmaras de ovo. Misture sempre o SM com insulina recém-adicionada e permita-lhe tempo suficiente para atingir a temperatura ambiente. Isso protege as câmaras de ovo contra choque frio, que pode ter um impacto negativo sobre o crescimento de microtúbulos e o alinhamento planar do citoesqueleto (como visto no desenvolvimento da asa de Drosophila ¹⁹).

As câmaras de ovo e os de selecionados são muito frágeis e, devido a seu tamanho pequeno, podem flutuar no SMI (SM com insulin). Recomenda-se deixá-los espontaneamente afundar no SMI. Eles também muitas vezes furar a dissecção fórceps/ferramenta de cacto. Em tal caso, deixe-os liberar-se dos dispositivos da dissecção delicadamente movendo os no SMI. Evite espremer e tocá-los diretamente em todos os momentos. Se necessário, exclua estas câmaras de ovo/ovarioles do protocolo adicional.

Como um estereoscópio de dissecção não é confiável para a identificação de câmaras de ovo danificadas/ovarioles, as câmaras de ovo/ovarioles devem ser verificados usando um corante CellMask ou FM 4-64 um microscópio de disco confocal/fiação. As câmaras danificadas do ovo mostram a coloração extrema em comparação a um fundo não danificado do tecido da câmara de ovo. Nunca adquira um TLM com manchas de corante fortes.

Etapas críticas e Troubleshooting para a imagem latente viva in vitro das câmaras de ovo

Se as câmaras de ovo coloc livremente no SMI ainda se movem, verific outra vez o microscópio confocal para ver se há ainda alguns restos negligenciados da folha e dos restos do músculo que flutuam no SMI. Removê-los e tente novamente. Das câmaras de ovo, 90% devem ser estáveis e imóveis durante a imagem latente subseqüente.

Para certificar-se de que uma câmara de ovo/ovariole selecionada é estável, use a imagem latente de alta velocidade (intervalos de 6 s) por 1 minuto. as câmaras de ovo instáveis mover-se-iam por este ponto. Entretanto, recomenda-se prestar atenção à gravação inteira do lapso de tempo para poder corrigir delicadamente um movimento inesperado potencial da câmara de ovo imaged. Isto pode ser feito movendo o estágio microscópico/tabela, que prende o prato de Petri com as câmaras de ovo cultivadas/ovarioles, à posição original de modo que a câmara de ovo do interesse esteja outra vez na janela imaged, focalizada.

Pare a imagem latente se um movimento repentino e inesperado da câmara de ovo imaged aparecer. Verific o amortecimento da tabela do microscópio, e Evite andar ao redor perto do microscópio durante o tempo da aquisição porque este pode conduzir ao rompimento da aquisição da imagem devido às vibrações causadas.

Se a tintura de membrana celular não for visível após 30 min e a linha laser usada estiver correta, acrescente mais do corante e aumente sua concentração para a próxima aquisição.

Se os sinais de actomiosina parecem estar borrados, verifique o NA do objetivo utilizado. Um NA inferior a 1,3 diminuirá a qualidade de imagem. Adicionalmente, certifique-se de que o óleo usado da imersão estêve aplicado corretamente ao objetivo da água 63x. Adicione ou substitua-o se necessário.

Se as câmaras de ovo encolhem e as membranas celulares observadas se deformam, verifique se a tampa está devidamente fechada. Se a tampa está faltando ou não devidamente fechado, as câmaras de ovo pode secar devido à evaporação SMI durante o tempo de aquisição.

Se a rotação das câmaras de ovo abrandar ou parar, diminua a potência do laser. Se um furo aparece na câmara de ovo, ele foi queimado pelo laser. Diminua a potência do laser.

Se a actomiosina sinalizar lixívia após 2 min durante a aquisição do TLM, diminua a potência do laser e aumente a amplificação do sinal no software do microscópio.

Uma vez que um TLM do epitélio do folículo de uma câmara de ovo foi adquirido, recomenda-se evitar a imagem latente outra vez na mesma região do tecido desta câmara de ovo. No entanto, como as câmaras de ovo giram em torno de seu eixo AP, é possível repetir a aquisição de um TLM usando esta câmara de ovo intacta após cerca de 30 min. Enquanto a imagem do epitélio folículo em uma câmara de ovo, outras câmaras de ovo não será branqueada/danificado, mesmo se eles estão localizados no mesmo ovariol ou em outro ovariol na SMI.

Se todos esses requisitos forem atendidos, a porcentagem de câmaras de ovo com sucesso deve ser cerca de 90% – 100% para os estágios 6 – 8, cerca de 50% – 60% para os estágios 3 – 5 e cerca de 20% – 30% para os estágios 1 –-2. A falha é principalmente devido ao movimento de câmaras de ovo ou danos a eles durante a sua dissecção/manipulação.

Etapas críticas e solução de problemas para processamento de dados

Durante a geração da máscara usando o certificado fornecido em Fiji, pode acontecer que há muitos esboços gerados da pilha que não refletem as membranas de pilha reais em um TLM. Isto é causado frequentemente pelo ruído de fundo elevado, especial quando as tinturas às membranas de pilha da mancha são usadas. Nesse caso, para evitar a correção tediosa de contornos de célula indesejados na máscara gerada, execute a segmentação novamente e defina os parâmetros para o melhor ajuste. Isso pode ser feito ajustando o parâmetro de tolerância a ruído estimado .

Ao carregar um dos arquivos ParticleStack. tif que contém contornos de célula no Gerenciador de superfície, o tempo de carregamento é dimensionado linearmente com o número de contornos de célula e pode levar vários minutos. Se o carregamento for interrompido ou incorreto, repita-o. Certifique-se de que a janela de carregamento está em foco e nenhum outro programa está sendo usado.

Às vezes, um contorno de célula precisa ser corrigido em alguns quadros; Nesse caso, use o botão Brush . Desenhe o contorno da célula correta em um quadro específico arrastando o mouse ao redor da membrana celular. Mova para um quadro diferente do TLM e, em seguida, retorne ao período de tempo com a correção: o contorno de célula incorreto agora deve ser substituído. Em seguida, vá novamente para o próximo quadro para corrigir esse. A ferramenta pincel agora alternará para o modo de apagamento. Se necessário, corrija os contornos nos próximos prazos empurrando o contorno da célula existente e pressionando o botão + Adicionar para criar um novo contorno de célula. Exclua o número S antigo da janela do Gerenciador de superfície e renomeie o novo contorno da célula pressionando o botão renomear , se necessário.

Se uma célula importante inteira estiver ausente em um TLM, crie um novo contorno de máscara pressionando unselect > Polygon. Crie um esboço novo da pilha no primeiro quadro do TLM estalando ao longo da membrana de pilha. Em seguida, vá para o último quadro do TLM e fazer o mesmo para a célula selecionada. Ao executar o filme no tempo, os contornos da célula serão interpolados. Corrija com a ferramenta pincel , se necessário. Uma vez terminado, pressione o botão + Add e renomeie o contorno da célula pressionando o botão renomear . Quanto mais pontos/cliques para criar um novo contorno de célula, a melhor interpolação funciona.

Além da rotação epithelial, os TLMs são afetados às vezes pelo movimento indesejado. Conseqüentemente, recomenda-se corrigir para tal tração do tecido nestes TLMs. Ao fazer isso, os TLMs também são corrigidos para a rotação epitelial das câmaras de ovo, e as membranas celulares tornam-se rígidas. Isso torna a análise manual dos sinais de actomiosina mais fácil. No entanto, tal abordagem não permite aos cientistas distinguir se os sinais de actomiosina observados se movem ou são estáticos em relação à membrana celular. Se uma distinção entre movimentos estáticos e ativos de sinais de actomiosina é o objetivo de tal análise, nenhuma correção de deriva tecidual deve ser aplicada. Nós encontramos que a maioria de sinais do actomiosina se movem ativamente relativo à membrana de pilha e somente uma parcela menor deles parece estático.

Etapas críticas e solução de problemas para a análise de sinais de actomiosina subcelular

Se as estatísticas geradas contiverem outliers, assegure-se de que todos os valores extremamente baixos ou altos com respeito ao conjunto de dados inteiro estejam refletindo verdadeiramente o comportamento na célula e não sejam artefatos. Isso pode ser feito identificando a célula que contém os valores atípicos e verificando a qualidade do contorno da célula no momento em que o valor baixo/alto foi medido. Muitas vezes, tais valores extremos resultam de contornos de células defeituosas que medem incorretamente parte de outra célula. Isso pode ser particularmente evidente quando grandes BLOBs interferem com o contorno de célula de uma célula vizinha. Nesse caso, é crucial corrigir os contornos das células e repetir a medição.

Para facilitar a quantificação, analise os sinais em uma determinada superfície celular e continue um a um até que todas as células sejam analisadas em um subfilme. Os resultados da análise manual de sinais de actomiosina subcellular não podem mostrar a quebra da simetria em uma pilha e em uma câmara de ovo particular. Nós experimentamos que o actomiosina não quebra claramente a simetria relativo ao movimento do tecido em < 10% das câmaras de ovo de giro (estágios 6 – 8). Este percentual é aumentado em torno do estágio 4¹². Verificou-se também que não há diferença se 5 min ou 10 min são analisados na identificação da direção preferida do movimento de sinal de actomiosina em uma câmara de ovo¹².

Etapas críticas e solução de problemas para a extração seletiva de sinais de actomiosina de tecidos curvados

O tamanho errado de BLOBs (sinais identificados) resultará em sem BLOBs e o programa congelará na próxima etapa. Neste caso, Force-Quit Fiji e reinicie recentemente o plugin Ellipsoid superfície Projection. Faça o mesmo quando o programa não reage após pressionar Compute. Isso geralmente é uma indicação de que os parâmetros inadequados foram escolhidos.

Se houver muitos BLOBs e/se eles estão concentrados em direção a um lado da câmara de ovo analisada, isso pode impactar o elipsóide projetado e não fornecer o ajuste correto para a câmara de ovo. Volte para a identificação do blob e tente organizar seu tamanho na combinação com a seleção de eixo x, y e z da câmara de ovo. Uma falha ao gerar um bom ajuste de elipsóides também ocorre frequentemente quando são usadas configurações de distância de corte inadequadas.

As projeções obtidas podem às vezes parecer desfocadas, ou talvez o plano z obtido realmente se mova entre as camadas celulares perto da superfície da câmara de ovo. Este é geralmente um sinal de um elipsóide mal apropriado onde uma região do elipsóide está ajustada demasiado distante da câmara de ovo. Tente caber o elipsóide de modo que mantenha a mesma distância da circunferência da câmara de ovo.

Limitações do método e novas abordagens

Este cultivo livre das câmaras de ovo omita o aplainamento subtil da superfície de uma câmara de ovo. Para este fim, este método tem suas vantagens e desvantagens. Ao usar a microscopia confocal, fornece usuários a imagem latente de alta resolução e de alta velocidade que descobre confiantemente o comportamento do actomiosina nas pilhas na circunferência de câmaras de ovo por um curto período de tempo (5 – 10 minutos). No entanto, ao fazê-lo, limita o tamanho de um único plano que pode ser imaged com microscopia confocal ao longo do tempo. Em geral, é possível a imagem de até ~ 15 células por câmara de ovo em estágios 6-8, mas apenas cerca de duas células em câmaras de ovo nos estágios 1 – 5. Portanto, definimos esse método aqui como sendo adequado apenas para a escala celular local.

Para superar esses limites de tamanho que são causados pelo tamanho limitado de um único plano confocal, desenvolvemos uma abordagem alternativa baseada em Fiji chamada projeção de superfície elipsóide, para uso na escala de tecido. Isto combina a microscopia de giro do disco com uma extração de superfície semiinterativa das câmaras de ovo na escala do tecido. Desta forma, os sinais de actomiosina podem ser obtidos ao mesmo tempo para mais de 50 – 100 células de uma câmara de ovo analisada. É importante notar que esta abordagem gera muito grandes conjuntos de dados adquiridos (~ giga bytes), tem uma resolução mais baixa (ele usa um 40x vs. um objetivo 63x), e também fornece uma velocidade de imagem mais lenta (que leva ~ 60 s para digitalizar através de metade do tecido de um ovo Cham [estágios 6 – 8] e, como tal, é 10x mais lenta do que o método de plano confocal limitado).

Comparado a outro software existente para extrair projeções em camadas de superfícies paramenizadas, o plugin desenvolvido para este protocolo é focado na facilidade de uso e feedback visual interativo em cada etapa do processo. Outras ferramentas, como a baseada em MATLAB ImSaNE²⁰, usada por Chen et al.²¹, concentram-se no manuseio de uma ampla variedade de modelos de superfície parametrizados e não parametrizados e vários métodos de projeção. Por exemplo, o ImSaNE requer que os dados sejam pré-processados e alinhados de uma forma específica e requerem parcialmente ferramentas externas em etapas intermediárias. Em contraste, o plugin apresentado aqui lida com qualquer imagem 3D/4D/5D (seqüência) que pode ser aberto em Fiji sem pré-processamento externo. Embora o ImSaNE seja altamente configurável (programável) Editando scripts MATLAB, fornecemos um conjunto mínimo de opções em um fluxo de trabalho que é adaptado ao problema específico discutido aqui. Cada etapa do fluxo de trabalho interativo fornece resultados que podem ser inspecionados e ajustados imediatamente visualmente, se necessário.

A decisão sobre qual dessas abordagens de imagem, a escala celular ou tecidual local, é a melhor para um experimento específico, depende puramente da questão científica a ser respondida (ou seja, maior versus resolução mais baixa; tempo de aquisição curto versus longo). Um bom compromisso entre estas duas escalas poderia ser combinar ambas as aproximações, assim ganhando a imagem latente de sinais do actomiosina na escala do semi-tecido (isto é, 20 – 30 pilhas). Isso requer um microscópio de disco giratório, uma lente de 63x de água com NA ≥ 1,3, e estabeleceu configurações de z-Stack para 20 – 30 células de uma câmara de ovo. Esta pilha z muito mais rasa (em contraste com a pilha z necessária para a aquisição de uma metade de uma câmara de ovo) permite uma digitalização mais rápida de menos de 60 s. O tempo ganho aqui pode ser usado para a aquisição repetida da pilha z para acelerar a imagem latente ou para uma recuperação da amostra (interleaves do tempo) entre pilhas z individuais. Com o último, um tempo de aquisição mais longo (> 30 minutos) de TLMs de câmaras de ovo de giro pode ser conseguido. Esta aproximação do semi-tecido garante uma suficiente definição para sinais do actomiosina e a imagem latente de mais pilhas ao mesmo tempo sobre uns períodos de tempo mais longos.

Aplicações e visão futuras

Ambos os métodos descritos (na escala local do celular e do tecido) fornecem uma aproximação simples e de baixo custo (excluindo dispositivos do microscópio) com efeitos secundários limitados na rede do actomiosina e podem ser executadas e adotadas facilmente para outros tecidos animais dissecados. O único pré-requisito aqui é um protocolo de cultivo existente em uma placa de Petri para um tecido curvo de interesse, transgenes disponíveis, e marcadores ou métodos de rotulagem.

Em combinação com a microscopia de fluorescência²²da luz-folha, é igualmente possível à maquinaria da actomiosina da imagem no Toto (isto é, imagem a superfície circunferencial exterior completa de câmaras do ovo de Drosophila simultaneamente e então subseqüentemente desdobrar usando o plugin de extração de superfície Ellipsoid). No entanto, existem algumas limitações que precisam ser resolvidas em termos de adequação para imagens de alta velocidade de sinais de actomiosina, ou seja, 1) a incorporação de câmaras de ovo em um agarose de fusão de ponto baixo ou sua aderência a um capilar durante a imagem; II) uma baixa abertura numérica de lentes de água usadas que não proporcionam uma resolução de sinal de actomiosina suficiente; III) o tempo adicional necessário para adquirir vários ângulos de câmaras de ovo, o que impede a imagem de alta velocidade.

Para este fim, é previsível que, com o refinamento dos parâmetros do microscópio, tais como a velocidade de varredura através do tecido epitelial e a melhoria das lentes microscópicas utilizadas, a análise detalhada da maquinaria de actomiosina irá, no futuro, permitir resultados promissores de alta resolução a serem obtidos no tecido e na escala Toto durante longos períodos de tempo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider Medium	Gibco	21720-024	[+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	[+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum	Sigma	F135	Heat inactivated
Insulin Solution Human	Sigma	I9278
50 mL Falcon tubes	Eppendorf		sterile
Millex-GV filter	Millipore	SLGV033NS	33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps	A. Dumont & Fils		#55
CellMask Deep Red (cell membrane dye)	Invitrogen	C10046
FM4-64 (cell membrane dye)	ThermoFisher/Invitrogen	T13320
Depression dissection slide	Fisher Scientific	12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope	e.g. Zeiss		Stemi SV 6
Inverted confocal microscope	e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope	e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass	e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder	Hammacher	9160020
Cactus spine	Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP			For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C			For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.