Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Merkel celle Polyomavirus infektion og påvisning

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/58950
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at inficere primære human dermal fibroblast med MCPyV. Protokollen omfatter isolering af dermal fibroblaster, udarbejdelse af MCPyV virioner, virusinfektion, immunofluorescens farvning og fluorescens i situ hybridisering. Denne protokol kan udvides til kendetegner MCPyV-værtssammenspil og opdage andre inficerbare celletyper ved MCPyV.

Abstract

Merkel celle polyomavirus (MCPyV) infektion kan føre til Merkel karcinom (MCC), en meget aggressiv form for hudkræft. Mekanistiske undersøgelser fuldt ud undersøge MCPyV Molekylærbiologi og muterede mekanismer har været hæmmet af en mangel på tilstrækkelige celle kultur modeller. Her, beskriver vi et sæt af protokoller for udførelse og afsløre MCPyV infektion af primære menneskelige hudceller. Protokollerne beskrive isolation af human dermal fibroblaster, forberedelse af rekombinante MCPyV virioner og påvisning af virusinfektion af både immunfluorescent (IF) farvning og in situ DNA-hybridisering kædereaktion (UNHCR), som er et meget følsomt Fluorescens i situ hybridisering (FISH) tilgang. Protokoller heri kan tilpasses af interesserede forskere til at identificere andre celletyper eller cellelinjer, der understøtter MCPyV infektion. Metoden beskrevet fisk kan også tilpasses til påvisning af lave niveauer af viral DNAs stede i den inficerede menneskelige hud.

Introduction

Merkel celle polyomavirus (MCPyV) er en lille, dobbelt-strenget DNA-virus, der har været forbundet med en sjælden men aggressiv hudkræft, Merkel celle karcinom (MCC)1,2. Dødeligheden af MCC, omkring 33%, overstiger værdien af melanom3,4. MCPyV har en cirkulær genom ~ 5 kb1,5 gennemskæres af en ikke-kodende regulerende region (NCRR) ind tidligt og sent kodende regioner1. NCRR indeholder replikation (Ori) og tovejs initiativtagere til viral transskription6,7viral oprindelse. Den tidlige region koder tumor antigen proteiner kaldet store T (LT), lille T (sT), 57kT, alternativ LT ORF (ALTO) samt en autoregulatory miRNA1,8,9,10. Den sene region koder kapsid proteiner VP1 og VP211,12,13. LT og sT er de bedst undersøgte proteiner, MCPyV og har været vist for viral DNA replikation og MCPyV-induceret tumordannelse5. Klonede integration af MCPyV DNA i vært genom, som er blevet observeret i op til 80% af MCC'er, er sandsynligvis en kausal faktor for virus-positiv tumor udvikling14,15.

Forekomsten af MCC er tredoblet over de sidste tyve år16. Asymptomatisk MCPyV-infektion er også udbredt i den almindelige befolkning17,18,19. Med det stigende antal MCC diagnoser og den høje prævalens af MCPyV infektion er der behov for at forbedre vores forståelse af virus og dens mutationer potentiale. Men mange aspekter af MCPyV biologi og muterede mekanismer fortsat dårligt forstået20. Dette er hovedsageligt fordi MCPyV replikater dårligt i etablerede celle linjer11,12,21,22,23 , og indtil for nylig, hud celler i stand til at støtte MCPyV infektion var ikke blevet opdaget22. Mekanistiske undersøgelser fuldt ud undersøge MCPyV og dens samspil med værtsceller har været hæmmet af en mangel på celle kultur system for formerings virus5.

Vi opdagede, at primære human dermal fibroblaster (HDFs) isoleret fra neonatal menneskelige forhuden støtte robust MCPyV infektion både in vitro- og ex vivo24. Fra denne undersøgelse etableret vi den første celle kultur infektion model for MCPyV24. Med udgangspunkt i denne modelsystem, viste vi at induktion af matrix metalloproteinase (MMP) gener af WNT/β-catenin signalering pathway og andre vækstfaktorer stimulerer MCPyV infektion. Desuden fandt vi, at FDA-godkendt MEK antagonist trametinib effektivt hæmmer MCPyV infektion5,25. Fra disse undersøgelser etableret vi også et sæt protokoller til isolering af human dermal fibroblaster24,25, forberede MCPyV virioner11,12, udføre MCPyV infektion af human dermal fibroblaster 24 , 25 og afsløre MCPyV proteiner af hvis farvning26. Derudover tilpasset vi den in situ DNA hybridisering kædereaktion (UNHCR) teknologi27 for at udvikle en meget følsomme fisk teknik (HCR-DNA fisk) til påvisning af MCPyV DNA i inficeret menneskers hudceller. Disse nye metoder vil være nyttige for at studere den smitsomme cyklus af MCPyV samt den cellulære reaktion på MCPyV infektion. De naturlige vært reservoir celler, der opretholder MCPyV infektion og de celler, der giver anledning til MCC tumorer forbliver ukendt. De teknikker, vi beskriver i dette manuskript kunne anvendes til at undersøge forskellige typer af humane celler til at identificere både reservoir-cellerne og oprindelsen af MCC tumorer. Vores etablerede metoder, som UNHCR-DNA fisk, kunne også være ansat i påvisning af andre DNA tumor vira og karakterisering af vært celle interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Menneskelige neonatal foreskins blev indhentet fra Penn hud sygdom Research Center. Voksne humane fibroblaster blev indhentet fra kasserede normal hud efter operationen. Alle protokollerne godkendtes ved University of Pennsylvania institutionelle Review Board.

1. isolering af human dermal fibroblaster

  1. Bruge et par saks til at trimme off fedt og subkutant væv fra menneskelige neonatal forhuden og skære hudprøve i halve eller kvarte.
  2. Inkuber væv i 5 mL 10 mg/mL dispase II i PBS suppleret med antibiotika-antimykotikum ved 4 ° C natten over.
  3. I en steril 10 cm parabol, omhyggeligt adskille epidermis fra de dermale lag ved hjælp af microdissection pincet.
  4. Overføre den resulterende dermal væv til en 15 mL konisk slange der indeholder 5 mL af 2 mg/mL collagenase type IV i FBS-frit medium suppleret med antibiotika-antimykotikum.
  5. Inkuber prøve ved 37 ° C i 5% CO2 til 4-6 h med periodiske ryster, indtil få makroskopisk væv aggregater tilbage.
  6. Frigive enkelt celler fra dermis af pipettering op og ned (triturating) kraftigt ti gange med 10 mL pipette.
  7. Der centrifugeres ved 180 x g i 5 min, og supernatanten.
  8. Plade de dissocierede celler i DMEM medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% L-glutamin ved 37 ° C i 5% CO2.

2. rekombinante MCPyV virion forberedelse

  1. Digest 50 µg for pR17b plasmid (transporterer MCPyV genom) med 250 U af BamHI-HF i en 200 µL volumen (4 timer ved 37 ° C) til at adskille det virale genom fra vektor rygraden (figur 2).
  2. Tilføje 1200 µL af buffer PB (suppleret med 10 µL af 3 M Karens, pH 5,2) til de nedbrudte DNA og rense over 2 miniprep spin kolonner (20 µg DNA kapacitet). Elueres fordøjet pR17b plasmid fra hver kolonne med 200 µL af TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA).
  3. Forberede ligatur reaktion i et 50 mL-centrifugerør. Tilføj 400 µL af renset plasmid DNA fra trin 2.2, 8,6 mL 1,05 x T4 ligase buffer og 6 µL af høj koncentration T4 ligase. Der inkuberes ved 16 ° C natten over.
  4. 45 mL buffer PB (suppleret med 10 µL af 3 M Karens, pH 5.2) tilsættes til ligation og bruge en vakuum manifold til at indlæse gennem 2 miniprep spin kolonner. Elueres hver kolonne med 50 µL af TE buffer. Forvente et udbytte af omkring 30 µg af DNA.
  5. I den sene eftermiddag/aften, seed 6 x 106 293TT28 celler ind i en 10 cm parabol indeholdende DMEM medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% L-glutamin uden hygromycin B.
  6. Den næste morgen, sikre at cellerne er omkring 50% sammenflydende. Transfect ved hjælp af 66 µL Transfektion reagens (1,1 µL/cm2), 12 µg re sammenskrevne MCPyV isolere R17b DNA fra trin 2.4, 8.4 µg af ST udtryk plasmidet pMtB og 9,6 µg LT udtryk plasmid PADI *29.
  7. Når de transfected celler er næsten sammenflydende, den følgende dag, trypsinize cellerne og overføre dem til en 15 cm parabol for fortsatte ekspansion.
  8. Du kan eventuelt tage et lille antal 293TT celler ved udvidelse og udføre hvis farvning for MCPyV LT (CM2B4) og VP1 (MCV VP1 kanin30) til at bestemme Transfektion effektivitet. På dette stadium, nukleare LT signal kan ses men VP1 udtryk sandsynligvis vil ikke kunne påvises.
  9. Når 15 cm parabol bliver næsten sammenflydende (normalt 5-6 dage efter første Transfektion), overføre cellerne i tre 15 cm retter. Høste celler fra 15 cm retter, når de bliver næsten sammenflydende og følg den virus høst protokol nedenfor.
    Bemærk: Eventuelt udføre kvalitetskontrol hvis som beskrevet i trin 2.8. De fleste af cellerne bør være både MCPyV LT og VP1 positivt på dette stadium.
  10. For at høste virussen, trypsinize celler, spin på 180 x g i 5 min på RT og Fjern supernatanten. Tilføje en celle pellet volumen af DPBS-Mg (DPBS med 9,5 mM MgCl2 og 1 x antibiotikum-antimykotikum). Derefter tilsættes 25 mM ammoniumsulfat (fra en 1 M pH 9 stamopløsning) efterfulgt af 0.5% Triton X-100 (fra en 10% stamopløsning), 0,1% Benzonase og 0,1% af en ATP-afhængig DNase. Bland godt og inkuberes ved 37 ° C natten over.
  11. Inkuber blanding i 15 min. på is og derefter tilføje 0,17 volumen af 5 M NaCl. Blandes og inkuberes i isbad i en anden 15 min. Spin i 10 min på 12.000 x g i en 4 ° C centrifuge. Hvis supernatanten ikke er klart, forsigtigt vendes røret og Gentag trinnet spinning. Overføre supernatanten til en ny tube.
  12. Resuspenderes med én volumen af DPBS suppleret med 0,8 M NaCl og spin igen, som beskrevet i trin 2.11.
  13. Kombinere analysere fra trin 2.11 og 2.12 og spin endnu en gang som beskrevet i trin 2.11.
  14. Hæld forløb af iodixanol i tynd væg 5 mL polyallomer rør af underlaying (27%, så 33% og 39%) ~0.7 mL trin ved hjælp af en 3 mL sprøjten udstyret med en lang nål eller p1000 pipette.
  15. Indlæse 3 mL klarede virus-holdige supernatanten på forberedt iodixanol gradient.
  16. Spin for 3,5 h 234,000 x g og 16 ° C i en SW55ti rotor. Indstille acceleration og deceleration for langsom.
  17. Efter ultracentrifugering, indsamle 12 fraktioner i Silikoniseret rør (hver fraktion er ~ 400 µL).
  18. Analysere brøker for forekomst af virus ved dsDNA reagens og/eller vestlige skamplet for VP1 (MCV VP1 kanin30). Pool gradient brøker med peak dsDNA og/eller VP1 indhold og karakterisere bestand af kvantitativ PCR til at beregne den virale genom svarende31. Gemme MCPyV virion bestanden ved-80 ° C.

3. infektion

  1. Vedligeholde primære human dermal fibroblaster i DMEM med 10% føtalt kalveserum, 1% ikke-essentielle aminosyrer og 1% L-glutamin. Ved ankomsten til sammenløbet, opdele fibroblaster 1:4 uden spinning ned.
    Bemærk: For højeste MCPyV infektion effektivitet, bruge primære fibroblaster mellem passager 5 og 12, der aktivt dividere på tidspunktet for plating.
  2. For at inficere human dermal fibroblaster, Aspirér medium og cellerne vaskes med DPBS.
  3. Der tilsættes 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA til fadet og der inkuberes ved 37 ° C i 5-10 min.
  4. Check under mikroskop for at sikre at cellerne kommer fra fadet.
  5. Der tilsættes 10 mL af DMEM/F12 medium indeholdende 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF og 3 µM CHIR99021, som stimulerer MCPyV infektion24, til fadet og celle opløsningen overføres til en 15 mL tube.
  6. Spin ned celler ved 180 x g i 2 min, og supernatanten. Resuspend celler i DMEM/F12 medium indeholdende 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL bFGF og 3µM CHIR99021 på 2-4 x 104 celler pr. mL.
  7. Seed 200 µL af cellesuspension suppleret med 1 mg/mL collagenase type IV i hver brønd af en 96-brønd plade. Optø MCPyV virion bestand på is. Tilføje 109 virale genom ækvivalenter af MCPyV virioner (beregnet i trin 2.18) pr. 1 µL af iodixanol for hver 2.500 og 5000 celler til at være inficeret.   Tryk forsigtigt på siden af pladen, og pladen anbringes i rugemaskinen.
  8. Efter inkubation ved 37 ° C i 5% CO2 for 48-72 h, tilføje 20% FBS til hver brønd.
  9. Tillad infektion at fortsætte ved 37 ° C i 5% CO2 i 72-96 timer.

4. immunfluorescent farvning

  1. Fix celler fremstillet i trin 3.9 med 3% PARAFORMALDEHYD i PBS i 20 min.
  2. Cellerne vaskes med PBS to gange.
  3. Inkuber celler i blokerer/permeabilization buffer (0,5% Triton X-100, 3% BSA i PBS filtreret gennem 0,22 µm filter) på RT for 1 h.
  4. Inkuber celler med de følgende primære antistoffer: mus monoklonale anti-MCPyV LT (CM2B4) (1:1000) og kanin polyklonale anti-MCPyV VP1 antistof (1: 2000), på RT for 3 h.
  5. Cellerne vaskes med PBS tre gange.
  6. Inkuber celler med de sekundære antistoffer: Fluor 594 ged anti-mus IgG (1:1000) og Fluor 488 ged anti-kanin IgG (1: 500) på RT for 1 h.
  7. Vaske cellerne med PBS tre gange.
  8. Counterstain celler med 0,5 µg/mL DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochlorid).
  9. Mount coverslips på glas dias og analysere ved hjælp af en omvendt fluorescens mikroskop.

5. In situ DNA-HCR

Bemærk: Denne teknik kræver at celler være seedet på coverslips. Til dette formål, kan infektion betingelserne beskrevet ovenfor (trin 3) skaleres til 24-godt plade-format.

  1. Fix celler dyrkes på coverslips med 4% PFA i PBS i 10 min. Skyl coverslips to gange med PBS, derefter behandle dem med 70% ethanol til permeabilize celler ved 4 ° C natten over.
    Bemærk: Fast prøver kan forblive i denne tilstand i flere dage.
  2. Pre krydse prøver ved at erstatte ethanolen med sonden hybridisering buffer og inkubere for 60 min. ved RT.
  3. Fortynd sonderne (1 µM) (tabel 1) i sonden hybridisering buffer løsning på 1: 500 fortynding 30 min før udgangen af trinnet pre hybridisering og inkuberes ved 45 ° C.
  4. For enden af inkubationer afpipetteres ~ 10 μl af de fortyndede sonde mix pr. coverslip på objektglas. Sted coverslips, celle-side ned, på deres respektive dråber af hybridisering sonde mix. Forsegle kanterne og backs i coverslips til dias med en liberal mængde gummi cement.
  5. Varme dias med tilføjet sonder på 94 ° C i 3 min ved at sætte dias på den flade side af en varme-blok. Overføre dias til et befugtet kammer og inkuberes ved 45 ° C natten over. For at gøre en simpel befugtet kammer, let dæmpe sterile papirhåndklæder med dH2O og plads i bunden af en plastikbeholder, der forsegler med en gummipakning.
    Bemærk: Under opvarmning gummi cement kan boble kort. Men sikre, at seglet ikke bryde.
  6. Omhyggeligt skræl væk gummi cement med pincet og placere coverslips celle-side op tilbage i wells af en 24-godt plade. Vask coverslips med sonden wash buffer på RT tre gange.
  7. Inkubér coverslip i forstærkning buffer (200 µL i 24-godt plader) på RT 30-60 min.
  8. I mellemtiden, at anneal hver af de to mærket oligonukleotid Hårnåle anerkende sonder (tabel 1) i separate PCR rør ved opvarmning til 94 ° C til 90 s og køling til RT i 30 min samtidig beskytte mod lys. Bland de to Hårnåle i forstærkning buffer, hver i en fortynding på 1:50.
  9. Gøre en overflade til forstærkning reaktion ved at strække paraffin film over den åbne ansigt af en 24-godt plade låg. Med pipette overfoeres 50-100 µL dråber af hårnål/forstærkning buffer blandingen på paraffin film for hver coverslip. Bruge pincet til fjern forsigtigt coverslips fra før forstærkning løsning. Tør coverslip ved at røre ved kanten til en porøs engangs tørre, og placere celle-side ned på forstærkning slipværktøjet.
  10. Plade låget holder coverslips i en fugtig kammer og der inkuberes natten over ved RT i mørke.
  11. Returnere coverslips brønde endnu. Inkuber prøver med 5 x SSCT [5 x natriumchlorid natriumcitrat (SSC) 0,1% Tween 20 filtreres gennem et 0,22 µm filter] indeholdende 0,5 µg/mL DAPI for 1 h på RT. vaske prøver to gange med 5 x SSCT på RT.
  12. Montere en coverslips på objektglas. Analysere cellerne og billede prøverne ved hjælp af en omvendt fluorescens mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den protokol, der er beskrevet i dette manuskript tilladt isolation af en næsten homogen population af HDFs (figur 1). Som det fremgår af immunfluorescent farvning, farvet næsten 100% dermal menneskeceller isoleret ved brug af de i denne protokol beskrevne betingelser var positivt for dermal fibroblast markører, vimentin og kollagen jeg24, men negative for menneskelige forhuden keratinocytter markør K14 (figur 1). Figur 2 viser processen til oprettelse af MCPyV virioner ved hjælp af rekombinante MCPyV genom og en virion stikprøve efter ultracentrifuge koncentration. Efter visualisering bandet af MCPyV virioner koncentreret i kernen af gradient (markeret med en pil i figur 2B), 500 µL fraktioner blev indsamlet og MCPyV qPCR blev udført for at identificere peak fraktioner. Et eksempel på qPCR analyse data er vist i figur 2C. I nogle andre forsøg, blev prøverne også analyseret med Western blotting ved hjælp af et kanin-anti-MCPyV VLP antistof (supplerende figur 1). Figur 3 viser immunfluorescent farvede billeder af HDFs inficeret med MCPyV. For at manuelt kvantificere positive celler, tælles vi mindst tre tilfældige udsigt over omkring 300 celler. Vi overveje celler, der er LT positive, VP1 positiv, eller både LT og VP1 positivt at være positiv for MCPyV infektion. I forsøgene vist i figur 3, 30% af celler er over LT positivt og mere end 10% er VP1 positive. MCPyV genomer replikeres i de inficerede celler blev fundet ved hjælp af både UNHCR-DNA fisk (figur 4A) og Immunofluorescent-UNHCR-DNA fisk (fig. 4B). Mens HCR-DNA fisk afslører lokalisering af MCPyV DNA i fabrikken replikation (foci) i figur 4A, Immunofluorescent-UNHCR-DNA fisk metoder giver mulighed for samtidige påvisning af både MCPyV DNA og LT protein Co lokalisering på replikering centrerer (fig. 4B). Billeder fra immunfluorescent-UNHCR-DNA fisk viste, at denne teknik kan bruges til at afsløre Co lokalisering af viral DNA og den tilknyttede viral protein.

Figure 1
Figur 1 . Human dermal fibroblaster isoleret fra neonatal menneskelige forhuden. Human dermal celler dyrkes i DMEM/F12 medium suppleret med 10% FBS blev plettet af antistoffer mod vimentin, kollagen, eller keratin 14 (K14). Cellerne var også counterstained med DAPI. Bar, 50 µm. Dette tal blev tilpasset fra Figur S2 i Liu et al., 201624. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Produktion af MCPyV virion ved hjælp af rekombinante virale genom. (A) A plasmid kort over pR17b (MCPyV genom plasmid). (B) en repræsentativt billede af en MCPyV virion prøve høstet og renset over et forløb. Pil markerer bandet af MCPyV virioner koncentreret i kernen af gradient. (C) den virale genom kopi nummer i hver gradient fraktion var kvantificeres ved hjælp af qPCR. Core gradient fraktioner (tal, tæller fra toppen af gradient, er angivet i bunden af grafen). Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (S.E.M.) af tre tekniske gentagelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Human dermal fibroblaster støtter robust MCPyV infektion, transskription, og replikering. Dermal fibroblaster isoleret fra menneskelige hud blev behandlet med MCPyV virioner i DMEM F12 medium indeholdende EGF, bFGF, CHIR99021 og collagenase IV for to dage. Efter skift til friske DMEM/F12 medium indeholdende 20% FBS for tre dage, celler blev immuno-farves ved hjælp af de angivne antistoffer og counterstained med DAPI. Mange af celler ikke kun har stærkt udtrykt LT og VP1 men også vise robust MCPyV replikering foci. Dette tal var tilpasset fra figur 3 af Liu et al., 201624. Skalere bar, 50 m. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Påvisning af MCPyV i inficerede celler ved hjælp af fisk teknikker. (A) menneskelige dermal celler dyrkes i DMEM/F12 indeholdende EGF, bFGF, CHIR99021 og collagenase type IV blev behandlet med MCPyV i 2 dage. Efter skift til friske DMEM/F12 indeholdende FBS for 3 dage, blev cellerne udsat for UNHCR-DNA FISH analyse. Cellerne var også counterstained med DAPI. (B) Human dermal celler dyrkes i medium indeholdende EGF, bFGF, og CHIR99021 blev enten ubehandlet (Mock) eller behandlet (inficeret) med MCPyV som beskrevet i (A). Cellerne blev udsat for immuno-fisk ved hjælp af LT antistof og MCPyV-specifikke DNA sonder før counterstaining med DAPI. HPV16 sonder blev brugt som en negativ kontrol. Skalalinjen, 10 m. Dette tal var tilpasset fra figur 4 af Liu et al., 201624. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Sonden navn Sekvenser
MCPyV probe 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probe 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagccccaagcctctgccaacttgaaaaaaaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probe 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactcatttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probe 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probe 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probe 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probe 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonden 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaggaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV probe 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaattttcgctttcttgagaatggaggaggggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
MCPyV sonde 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtgtctgcggcttgttggcaaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgggtcct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcggggtggttggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
HPV sonde 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtaccctcttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabel 1: Sonder anvendes i undersøgelsen.

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1. Screening Iodixanol gradient brøker for MCPyV VP1. MCPyV-inficerede celler blev mængden og underkastes Iodixanol gradient fraktionering. Core gradient fraktioner (numre, regnet fra bunden af farveforløb i dette eksperiment er angivet øverst i figuren) blev udsat for Western blot analyse at opdage VP1. 10 µL prøver af hver fraktion blev justeret til 1 x belastning farvestof med en 5% endelige koncentration af 2-mercaptoethanol og kortvarigt opvarmes til 65 ° C. Prøverne blev adskilt på en 4-12% bis-Tris gel og renset på nitrocellulose. Western blotting blev gennemført i TBST med nonfat tørt mælk ved hjælp af et kanin-anti-MCPyV VLP antiserum fortyndet 1:5000. Antiserum er tilgængelige efter anmodning. De 50 kDa standard (som trækker ligeledes til de 47 kDa MCPyV VP1 monomer) er markeret med en asterisk. I det viste billede, prøve reduktion var ufuldstændige og disulfid-linked VP1 multimerer er synlige. Brug af dithiothreitol og/eller højere denaturering temperaturer kan resultere i mere fuldstændig reduktion til VP1 monomer arter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder, der er beskrevet ovenfor, herunder isolering af dermal fibroblaster fra huden væv, forberedelse af rekombinante MCPyV virioner, infektion af dyrkede celler, immunfluorescent farvning og en følsomme fisk metode tilpasset fra UNHCR teknologi, som skal give forskerne til at analysere MCPyV infektion27. Et af de mest afgørende skridt til at opnå MCPyV infektion in vitro-er produktion af high-titer virion præparater. Ved hjælp af protokollen til forberedelse af rekombinante MCPyV virioner beskrevet her, opnå vi viral titers 1012 genom eksemplarer pr. mL af idoxanol opløsningsmiddel11,12. Disse high-titer MCPyV præparater gav os mulighed for at identificere HDFs som kun primære hud celletype hidtil synes at støtte den fulde MCPyV infektion cyklus24.

Isolere frisk human dermal fibroblaster ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i dette manuskript har aktiveret os til kontrol af kvaliteten af de celler, der bruges i MCPyV infektion eksperimentere og sikre ensartede resultater på tværs af celler isoleret fra forskellige patientprøver. Alle human dermal fibroblaster isoleret fra neonatal hud bør vurderes for tilstedeværelsen af MCPyV DNA af qPCR at sikre fravær af MCPyV infektion før behandling med rekombinante MCPyV virioner. For at opnå den maksimale MCPyV infektion effektivitet, er det kritisk at bruge human dermal fibroblaster isoleret frisk fra neonatal menneskelige forhuden som højere passage fibroblaster støtte lavere MCPyV infektion effektivitetsgevinster. Yderligere, da isolerede parallelt fra voksen hud prøver, fibroblaster fra neonatal hud prøver støttes meget højere MCPyV infektion effektivitet24. Vi har aldrig testet alle kommercielt tilgængelige celler til MCPyV infektion. Men vi ser ingen specifik grund der kommercielt isoleret fibroblaster skal være ringere end hvis de højere passage ved frysning.

Vi har også brugt protokollen beskrevet her til at isolere dermal fibroblaster fra andre dyr. For eksempel har vi brugt protokollen held isolere dermal fibroblaster fra mus (Mus musculus), rotte (Rattus norvegicus), tree spidsmus (Tupaia Belangeri) og rhesus makak (Macaca mulatta)25. Som bemærket i humane celler, fibroblaster isoleret fra yngre chimpanser tilladt langt mere effektive MCPyV infektion i forhold til de ældre dyr25.

Sammenlignet med traditionelle fisk, er fisk, UNHCR-DNA en enkel, men meget følsom metode til påvisning af viral genomer24,27. Centre for MCPyV replikering kan let påvises i kerner af inficerede celler som meget specifikke punktformet foci, med lidt at ingen baggrund signal opdaget i de samme prøver behandlet med en HPV specifikke sonde (figur 4)24. Tilgangen kunne i fremtiden, derfor undersøges for at opdage lav-overflod MCPyV DNA i inficeret menneskers hud. Det kunne også være tilpasset til at overvåge andre DNA virus. Når det kombineres med immunfluorescent farvning, giver immuno-fisk en kraftfuld metode til samtidig påvisning af viral DNA og enten viral kodet protein eller vært proteiner til stede i de samme celler (figur 4). For at opnå optimale resultater ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet her, er det bedst at bruge frisk faste prøver for immunfluorescent farvning og UNHCR-DNA FISH analyse. Til analysen af UNHCR-DNA fisk, skal sonder og forstærker opbevares i-80 ° C i små prøver at undgå gentagen nedfrysning og optøning.

Ved hjælp af HDF cellekultur og MCPyV infektion protokol, vi har undersøgt de celle vækstbetingelser, der bedst understøtter MCPyV indrejse, transskription og replikation i HDFs. Vi opdagede at behandling af HDFs med vækstfaktorer, såsom EGF, bFGF og stimulation af WNT signal pathway betydeligt fremme MCPyV infektion. Gen expression profilering afslører, at ved stimulation med disse vækstfaktorer og aktivering af WNT signalering pathway, flere gener af familien matrix metalloproteinase (MMP), herunder MMP1, 3, 7, 9, 10, 11 og 13, blev håndfast induceret. Fordi disse MMP enzymer er i stand til i nedværdigende ekstracellulære matrix proteiner, grunden vi til at de kan stimulere MCPyV infektion ved at forstyrre den ekstracellulære matrix af værtsceller. Ja, behandling af HDFs med collagenase type IV, et medlem af familien MMP håndfast stimulerer MCPyV infektion (figur 3)24. Vi har også screenet en bred vifte af forbindelser, herunder flere FDA-godkendt kinase hæmmere, for hæmmende effekt på MCPyV infektion. Vi opdagede, at trametinib, en MEK1 og MEK2-hæmmer, hæmmer dramatisk MCPyV infektion24. Andre kan bruge eller ændre denne infektion system som en drug discovery platform for MCPyV-hæmmere, der reducerer MCPyV virusmængde i immunsvækkede patienter.

I Resumé giver disse protokoller for at opnå højeffektive MCPyV infektion en platform til at belyse de dårligt forstået MCPyV smitsomme cyklus og MCPyV-induceret muterede mekanismer inden for rammerne af virusinfektion. Dette sæt af protokoller, der kunne anvendes i fremtidige undersøgelser at udforske yderligere MCPyV-eftergivende menneskelige celletyper, og de oprindelige celler af MCC, i hvilke utilsigtede MCPyV infektion kan føre til tumor udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) og Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) for at give reagenser og teknisk support. Vi takker også medlemmerne af vores laboratorier for nyttig diskussion. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) tilskud (R01CA187718, R01CA148768 og R01CA142723), NCI Cancer Center støtte Grant (NCI P30 CA016520) og Penn CFAR award (P30 AI 045008).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 144 Merkel celler polyomavirus isolation dermal fibroblaster infektion collagenase IV CHIR99021 immunfluorescent farvning fluorescens i situ hybridisering in situ DNA-hybridisering kædereaktion transskription replikering
Merkel celle Polyomavirus infektion og påvisning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B.,… More

Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter