الثقافة الأولية من خلايا الفئران البطاني وفحوصات لوظائف ستيرويدوجينيك
Summary
هرمون يفرز من قشرة الغدة الكظرية حيوية بالنسبة للحيوانات ضد الإجهاد والأمراض. وهنا نقدم بروتوكولا لثقافة الفئران الابتدائي خلايا الغدة الكظرية. يمكن أن يكون منبرا جيدا في المختبر للتحقيق في آليات كاشف الفائدة في الغدة الكظرية ستيرويدوجينيسيس والحيوي الدهن.
Abstract
الهرمونات التي تفرز قشرة الغدة الكظرية حيوية بالنسبة للحيوانات ضد الإجهاد والأمراض. الأسلوب الموصوفة هنا هو الإجراء من خلايا الغدة الكظرية الأولية الفئران مثقف والاختبارات الوظيفية ذات الصلة (الفلورة تلطيخ الدهني الحبرية البروتين السطحية، فضلا عن تحليل القشري). خلافا لنموذج في الحية، وتفاوت إينتيريكسبيريمينتس في ثقافات أحادي الطبقة الغدة الكظرية أقل وحالة تجريبية من السهل التحكم. وعلاوة على ذلك، أيضا مصدر للفئران أكثر استقرارا من غيرها من الحيوانات مثل الأبقار منها. وهناك أيضا عدة خطوط الخلايا البشرية الغدة الكظرية (NCI-H295، NCI-H295R، SW13، إلخ) التي يمكن استخدامها في الدراسات الغدة الكظرية. بيد سيتأثر إنتاج المنشطات من هذه الخطوط لا تزال بعوامل عديدة، والتي تشمل رقم الشحنة المصل، رقم مرور المسخ/فقدان الجينات متميزة، إلخ. باستثناء تفتقر إلى 17α-hydroxylase، ثقافة الفئران البطاني الخلايا الأولية تقنية أفضل وأكثر ملاءمة لدراسة فيزيولوجيا الغدة الكظرية. وباختصار، يمكن الثقافات الغدة الكظرية الأولية الفئران منصة في المختبر جيدة للباحثين للتحقيق في آليات الكاشف للفائدة في نظام الغدة الكظرية.
Introduction
نظام الغدد الصماء المسؤولة عن تنظيم الأنشطة الفسيولوجية والتوازن1. الغدد الكظرية الموجودة في القطب الجمجمة الكلي هي أحد الأجهزة الرئيسية الغدد الصماء التي تفرز مينيرالوكورتيكويدس والكورتيزون الاندروجين2،3. هناك اثنين من الأجزاء المميزة في الغدة الكظرية: القشرة ولب. قشرة الغدة الكظرية تتكون من ثلاث طبقات: glomerulosa الخارجي، فاسسيكولاتا المتوسط، و قد الداخلية3. جلوميرولوسا زونا هو موقع المبيضي الأصلي الدوستيرون، مينيرالوكورتيكويد، الذي يساعد في استيعاب أيون الصوديوم والماء في الكلي3. وتنتج فاسسيكولاتا زونا أساسا مستوى القاعدي الكورتيزون في الظروف الفسيولوجية العادية3. القشرية في القوارض وهرمون الكورتيزول في قانون البشر مساعدة الهيئة في التعامل مع الإجهاد بتنظيم الجلوكوز في الدم3. إلى حد ما، أنها تمنع الردود التحريضية وتنظيم الجهاز المناعي4،5. خلافا لغيرها من الثدييات، والفئران والجرذان لا تملك قد زونا فنية نظراً لعدم وجود تعبير 17α-hydroxylase في6،الغدة الكظرية7. وهكذا، الغدة الكظرية من الفئران والجرذان تخلو من إفراز الغدة الكظرية C-19 المنشطات (هرمون الكورتيزول ومنشطات الغدة الكظرية).
خلايا البطاني مثقف الأولية أظهرت أن تكون مفيدة للتحقيق في آليات مراقبة فيزيولوجيا الغدة الكظرية8. مثل الأنسجة الأخرى ستيرويدوجينيك، يجمع كل منطقة الغدة الكظرية المنشطات من الكوليسترول الحرة9. عند تنشيط هرمون ﻫﺭﻣﻭﻧ (ACTH)، الكوليسترول الحر أطلق سراحه من قطرات الدهن انهيار، وهكذا، يعزز إنتاج الستيرويد في فاسسيكولاتا وقد10.
وحاولت العديد من المجموعات إنشاء خطوط الخلايا مستقرة من الأورام السرطانية البطاني. ومع ذلك، العديد من الشواغل محدودة استخدام خطوط الخلية البطاني كما هو الحال في المختبر نماذج8. قد تختلف الردود ستيرويد من خطوط الخلايا بين الممرات، والعدد الكثير من المصل، ونوعية المصل، إلخ. وعلاوة على ذلك، خطوط خلايا الغدة الكظرية التجارية (Y1 و SW13) لا تفرز القشري، مما يجعل من الصعب أكثر دراسة الغدة الكظرية ستيرويدوجينيسيس8. استخدام الغدة الكظرية الأبقار والخيول كما السابقين فيفو نماذج قد يكون اختياراً جيدا، على الرغم من الأنسجة من هذه الأسواق قد يحجب بعض المخاطر غير معروف. مقارنة لهم، إدارة الغدد الكظرية الجرذ أسهل والمصدر نسبيا أكثر استقرارا وخالية من مسببات الأمراض. أخذت معا، يمكن استخدام هذا الأسلوب الموصوفة هنا للتحقيق ذات الصلة إليه التوليف القشري في خلايا الغدة الكظرية فاسسيكولاتا الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
الغدد الكظرية دوراً رئيسيا في التكيف مع البيئة3. ويمكن تنظيم الهرمونات التي تفرز قشرة الغدة الكظرية وضبط الوظائف الفسيولوجية والتوازن3. ويعكس نموذج المجراة في الآثار الفسيولوجية الحقيقية في الجسم. بيد أنها لا تزال تتأثر بالعديد من العوامل المعقدة، تتسبب في آثار …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بمنحه من تايوان مجلس العلوم الوطني (NSC102-2320-B-037-008-MY3) والوطني تشنغ-الكونغ “جامعة مستشفى منحة بحثية” (نكوه-10102045).
Materials
| female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| forceps | BRAUN | BD331R | |
| scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| inverted light microscopy | Leica | ||
| fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H., Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. , 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. . Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
