Primaire cultuur van Rat Adrenocortical cellen en testen van Steroidogenic functies
Summary
Het hormoon afgescheiden door de bijnierschors is van vitaal belang voor dieren tegen stress en ziekten. Hier presenteren we een protocol bij de cultuur de primaire rat bijnier cellen. Het zou een goede in-vitro platform voor onderzoek naar de mechanismen van het reagens van belang in de bijnier steroidogenesis en lipide biosynthese.
Abstract
Het hormoon die de bijnierschors scheidt is van vitaal belang voor dieren tegen stress en ziekten. De hier beschreven methode is de procedure van primaire gekweekte rat bijnier cellen en verwante Functionele assays (immunofluorescentie kleuring van lipide druppel oppervlakte-proteïne, evenals corticosterone analyse). In tegenstelling tot een in vivo model, de variatie van de interexperiments in de bijnier enkelgelaagde culturen is minder en de experimentele conditie is makkelijk te controleren. Bovendien, is de bron van ratten ook stabieler dan andere dieren zoals runderen ones. Er zijn ook verschillende menselijke bijnier cellijnen (NCI-H295 NCI-H295R, SW13, etc.) die kunnen worden gebruikt in de bijnier studies. De steroïde productie van deze regels zal echter nog steeds worden beïnvloed door talrijke factoren, waaronder serum lotnummer, passage nummer, mutant/verlies van verschillende genen, enz. Met uitzondering van 17α-hydroxylase ontbreekt, is de primaire cultuur van rat adrenocortical cellen een beter en handiger techniek voor het bestuderen van de bijnier fysiologie. Kortom zou de primaire rat bijnier culturen een goede in-vitro platform voor onderzoekers te onderzoeken van de mechanismen van het reagens van belang in de bijnier-systeem.
Introduction
Het endocriene systeem is verantwoordelijk voor de regulering van de fysiologische activiteiten en homeostase1. Bijnieren, gelegen aan de craniale pool van de nieren zijn een van de belangrijkste endocriene organen die mineralocorticoids, glucocorticoïden en androgeen2,3 afscheiden. Er zijn twee verschillende delen van de bijnier: de cortex en de medulla. De bijnierschors bestaat uit drie lagen: de buitenste glomerulosa, de tussenliggende fasciculata en de innerlijke reticularis3. De zona glomerulosa is de oorspronkelijke dat site van aldosteron, een Mineralocorticoïden, die helpt bij het ion van natrium en water in de nieren3geabsorbeerd. De fasciculata van de zona produceert voornamelijk een basale niveau van glucocorticoïden in normale fysiologische omstandigheden3. Corticosteroïden bij knaagdieren en cortisol in mensen handelen binnen het lichaam helpen in het omgaan met stress door het reguleren van bloed glucose3. Tot op zekere hoogte kunnen remmen inflammatoire reacties en reguleren het immuunsysteem4,5. In tegenstelling tot andere zoogdieren, muizen en ratten geen hebben een functionele zona reticularis vanwege het ontbreken van een 17α-hydroxylase expressie in de bijnier6,7. Bijnieren van muizen en ratten zijn dus verstoken van de secretie van bijnier C-19 steroïden (cortisol en bijnier-androgenen).
Primaire gekweekte adrenocortical cellen is aangetoond dat het nuttig is voor het onderzoeken van de mechanismen waarmee de bijnier fysiologie8worden bestuurd. Net als andere steroidogenic weefsels synthetiseert elke bijnier zone zijn steroïden van gratis cholesterol9. Op adrenocorticotropic hormoon (ACTH) stimulatie, de gratis cholesterol wordt vrijgelaten uit de uitsplitsing lipide druppels en, dus, verbetert steroïde productie in de fasciculata en reticularis10.
Vele groepen hebben geprobeerd om stabiele cellijnen van adrenocortical carcinomen. Verschillende zorgen hebben echter slechts beperkt het gebruik van adrenocortical cellijnen in vitro modellen8. De steroïde reacties van cellijnen kunnen verschillen tussen passages, het lotnummer van het serum en de kwaliteit van de serum, enz. Bovendien doen de commerciële bijnier cellijnen (Y1 en SW13) niet corticosterone, waardoor het moeilijker om te studeren bijnier steroidogenesis8afscheiden. Met behulp van runderen en paarden bijnieren zoals ex vivo modellen een goede keuze wellicht, hoewel weefsels van deze markten sommige onbekende risico’s verdoezelen kunnen. Vergeleken met hen, beheer van rat bijnieren is makkelijker en de bron is relatief meer stabiel en pathogenen vrije. Tezamen, kan de huidige hier beschreven methode worden gebruikt om te onderzoeken het verwante mechanisme van corticosterone synthese in rat bijnier fasciculata cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bijnieren spelen een sleutelrol in milieu aanpassing3. Het hormoon dat door die de bijnierschors scheidt kunt reguleren en fysiologische functies en homeostase3aanpassen. De in vivo model weerspiegelt de echte fysiologische effecten in het lichaam. Het is echter nog steeds beïnvloed door vele complexe factoren, unstable effecten veroorzaken in experimenten. Daarentegen heeft de in vitro cell model voordelen waardoor het onvergelijkbaar met de diermodel. Ten eerste is de mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de National Science Raad Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) en een nationale Cheng-Kung Universiteit ziekenhuis onderzoeksbeurs (NCKUH-10102045).
Materials
| female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| forceps | BRAUN | BD331R | |
| scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| inverted light microscopy | Leica | ||
| fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H., Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. , 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. . Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
