Culture primaire de cellules Corticosurrénaliennes Rat et tests des fonctions Stéroïdogéniques

Summary

L’hormone sécrétée par le cortex surrénalien est vital pour les animaux contre le stress et les maladies. Nous présentons ici un protocole à la culture le rat primaire les cellules surrénales. Ça pourrait être une bonne plateforme in vitro pour étudier les mécanismes du réactif d’intérêt dans la stéroïdogénèse surrénalienne et la biosynthèse des lipides.

Abstract

L’hormone qui sécrète de la corticosurrénale est vital pour les animaux contre le stress et les maladies. La méthode décrite ici est la procédure de cellules surrénaliennes cultivés primaires de rat et des tests fonctionnels (immunofluorescence souillant de protéine de surface de gouttelettes lipidiques, ainsi que l’analyse corticostérone). Contrairement à un modèle in vivo, la variation d’interexperiments dans des cultures monocouches surrénalienne est inférieure et la condition expérimentale est facile à contrôler. En outre, la source des rats est aussi plus stable que les autres animaux, comme les bovins ones. Il y a aussi plusieurs lignes de cellules surrénales humaines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) qui peuvent être utilisées dans les études surrénaliennes. Cependant, la production de stéroïdes de ces lignes sera toujours influencée par de nombreux facteurs, qui comprennent le numéro de lot de sérum, nombre de passage, mutant/perte de gènes distincts, etc.. Sauf faute de 17α-hydroxylase, la culture primaire de cellules corticosurrénaliennes rat est une technique mieux et plus pratique pour l’étude de la physiologie surrénalienne. En résumé, les glandes surrénales cultures primaires de rat pourraient être une bonne plateforme in vitro pour les chercheurs d’étudier les mécanismes du réactif d’intérêt dans le système de la glande surrénale.

Introduction

Le système endocrinien est chargé de réglementer les activités physiologiques et l’homéostasie du¹. Les glandes surrénales situées au pôle crânial des reins sont l’un des principaux organes endocrines qui sécrètent les minéralocorticoïdes, glucocorticoïdes et androgènes^2,3. Il y a deux parties distinctes de la glande surrénale : le cortex et la médulla. Le cortex surrénalien se compose de trois couches : la glomérulée externe, le fasciculata intermédiaire et les reticularis interne³. La zone glomérulée est le site original de sécrétion d’aldostérone, un minéralocorticoïde, qui facilite en résorbant les ions sodium et eau dans les reins à³. Le fasciculata de zona produit principalement un niveau basal des glucocorticoïdes dans des conditions physiologiques normales³. Corticostéroïdes chez les rongeurs et le cortisol chez l’homme agissent pour aider le corps à gérer le stress en régulant le débit sanguin de glucose³. Dans une certaine mesure, ils peuvent inhiber les réponses inflammatoires et réguler le système immunitaire^4,5. Contrairement aux autres mammifères, les souris et les rats n’ont pas un reticularis de zona fonctionnelle en raison de l’absence d’une expression 17α-hydroxylase dans la glande surrénale^6,7. Ainsi, les glandes surrénales de rats et de souris sont dépourvues de la sécrétion des stéroïdes de C-19 surrénales (cortisol et androgènes surrénaux).

Primaire des cellules corticosurrénales ont est avérés utile pour étudier les mécanismes contrôlant la physiologie surrénalienne⁸. Comme les autres tissus stéroïdogènes, chaque zone surrénalienne synthétise ses stéroïdes du cholestérol libre⁹. Lors de la stimulation de l’hormone adrénocorticotrope (ACTH), le cholestérol libre est libéré de gouttelettes lipidiques de ventilation et, par conséquent, améliore la production de stéroïdes chez le fasciculata et reticularis¹⁰.

Plusieurs groupes ont tenté d’établir des lignées stables de carcinomes corticosurrénales. Toutefois, plusieurs préoccupations ont limité l’utilisation de lignées de cellules corticosurrénaliennes comme vitro modèles⁸. Les réponses de stéroïdes de lignées cellulaires peuvent différer entre les passages, le numéro de lot du sérum et la qualité du sérum, etc.. En outre, des lignées de cellules surrénaliennes commerciale (Y1 et SW13) ne pas sécréter corticostérone, rendant plus difficile à étudier la stéroïdogénèse surrénalienne⁸. L’utilisation des surrénales bovines et équines comme ex vivo modèles peuvent être un bon choix, même si les tissus de ces marchés peuvent occulter certains risques inconnus. Comparé à eux, gestion des glandes surrénales de rat est plus facile et la source est relativement plus stable et exempts de micro-organismes pathogènes. Pris ensemble, la présente méthode décrite ici pourrait être utilisée pour étudier le mécanisme de synthèse de la corticostérone dans les cellules surrénales fasciculata rat.

Protocol

Toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par animalier institutionnel et utilisation Comité de Kaohsiung Medical University. 1. marche à suivre Sacrifier les rats de SD femelle/mâle adulte (8 à 12 semaines) en CO2 euthanasie. Appliquer de l’éthanol à 70 % et laissez-le être absorbée par la peau et puis essuyer la peau avec un papier de soie. Mettre le rat sur une plaque de plastique propre en décubitus dorsal.<…

Representative Results

En utilisant la procédure décrite ici, les cellules surrénales cultivés primaires se distinguaient sous un microscope à contraste de phase (Figure 1 a). Pour confirmer que les vésicules dans le cytoplasme sont des gouttelettes lipidiques, la coloration à l’immunofluorescence de protéine de liées à la différenciation adipeuse (PACA) pourrait être réalisée sur des cultures de jour-3 (Figure 1 b). Les cellules ont é…

Discussion

Les glandes surrénales jouent un rôle clé dans l’adaptation environnementale³. Le par lequel la corticosurrénale sécrète l’hormone permettant de régler et ajuster les fonctions physiologiques et l’homéostasie du³. Le modèle in vivo reflète les effets réels physiologiques dans le corps. Toutefois, il est toujours influencée par de nombreux facteurs complexes, provoquant des effets instables dans les expériences. En revanche, le modèle in vitro de cellules…

Materials

female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk)	BioLASCO		male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments
collagenase, type II	Sigma	C-6885	isolation of adrenal cells
DMEM	ThermoFisher	12800-017	powder media for adrenal cells
Ham's F12	ThermoFisher	21700-075	powder media for adrenal cells
HEPES	JT.baker	4018	buffer (powder)
NaHCO3	JT.baker	3506-1
Horse serum	Hyclone	16050014
Fetal bovine serum	SAFC	12103C
penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml)	Corning	30-002-Cl	antibiotics
curved forceps	BRAUN	BD343R
forceps	BRAUN	BD331R
scissor	BRAUN	BC224R	cut rat skin and muscle
delicate scissor	BRAUN	BC101R	cut adrenal glands
adipose-differentiation related protein	Abcam	ab108323	antibody for lipid droplet associated protein
corticosterone ELISA kit	cayman	500655	assay for corticosterone synthesis
inverted light microscopy	Leica
fluorescence microscope	Nikon
Triton X-100	JT.baker	X198-07	for immunofluorescence staining
goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody	ThermoFisher	A-11034	for immunofluorescence staining
anti-ADFP	Abcam	108323	for immunofluorescence staining
ProLong Gold antifade mountant	ThermoFisher	P36935	for immunofluorescence staining