Cultura primária de células Adrenocortical rato e ensaios das funções reguladora
Summary
O hormônio secretado pelo córtex adrenal é vital para os animais contra doenças e estresse. Aqui, apresentamos um protocolo para cultura o rato primário células adrenais. Pode ser uma boa plataforma in-vitro para investigar os mecanismos do reagente de interesse na esteroidogênese adrenal e biossíntese de lipídios.
Abstract
O hormônio que segrega o córtex adrenal é vital para os animais contra estresse e doenças. O método descrito aqui é o procedimento de células adrenais primários rato culta e relacionados ensaios funcionais (mancha da imunofluorescência de proteína gotículas lipídicas, bem como análise de corticosterona). Ao contrário de um modelo in vivo, a variação de interexperiments em culturas de monocamada adrenal é menor e a condição experimental é fácil de controlar. Além disso, a fonte de ratos também é mais estável do que outros animais, como bovinos ones. Existem também várias linhas de célula humana adrenal (NCI-H295 NCI-H295R, SW13, etc) que podem ser usadas em estudos de adrenais. No entanto, a produção de esteroides dessas linhas será ainda influenciada por inúmeros fatores, que incluem o número de lote de soro, número de passagem, mutante/perda de genes distintos, etc. Exceto por falta de 17α-hidroxilase, a cultura primária de células de rato adrenocortical é uma técnica melhor e mais conveniente para estudar fisiologia renal. Em resumo, culturas adrenal primária rato poderiam ser uma boa plataforma in vitro por pesquisadores investigar os mecanismos do reagente de interesse no sistema de glândula adrenal.
Introduction
O sistema endócrino é responsável pela regulação de atividades fisiológicas e homeostase1. Glândulas supra-renais localizadas no polo cranial dos rins são os principais órgãos do sistema endócrino que segregam mineralocorticoides, glicocorticoides e androgênios2,3. Há duas partes distintas da glândula supra-renal: o córtex e a medula. O córtex adrenal consiste em três camadas: o exterior glomerulosa, fasciculada a intermediário e o reticular interno3. A zona glomerulosa é o site original secretando de aldosterona, um mineralocorticoide, que auxilia na reabsorvendo o íon de sódio e água nos rins3. A zona fasciculada principalmente produz um nível basal de glicocorticoides em condições fisiológicas normais3. Corticosteroides em roedores e cortisol em humanos agir para ajudar o corpo em lidar com o estresse, regulando a glicose de sangue3. Em certa medida, eles podem inibir respostas inflamatórias e regular o sistema imunológico4,5. Em contraste com outros mamíferos, camundongos e ratos não têm um funcional zona reticular devido à falta de uma expressão de 17α-hidroxilase na glândula adrenal6,7. Assim, as glândulas supra-renais de camundongos e ratos são desprovido de secreção de esteroides adrenais de C-19 (cortisol e andrógenos adrenais).
Culturas de células adrenocortical primárias foram mostradas para ser útil para investigar mecanismos controlando a fisiologia renal8. Como outros tecidos esteroidogênica, cada zona adrenal sintetiza seus esteroides de colesterol livre9. Após estimulação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), o colesterol livre é liberado de gotículas lipídicas de repartição e, assim, aumenta a produção de esteroides na10fasciculada e reticular.
Muitos grupos têm tentado estabelecer linhas de célula estável de carcinomas de adrenocortical. No entanto, várias preocupações têm limitado a utilização de linhas de célula adrenocortical, como na vitro modelos8. As respostas de esteroides de linhas celulares podem diferir entre passagens, número de lote do soro e a qualidade do soro, etc. Além disso, linhas de células adrenais comercial (Y1 e SW13) não secretam corticosterona, tornando mais difícil para estudar a esteroidogênese adrenal8. Bovinas e equinos supra-renais usando como ex vivo modelos podem ser uma boa escolha, mesmo que os tecidos de nesses mercados podem obscurecer alguns riscos desconhecidos. Comparado a eles, gerenciar as glândulas supra-renais do rato é mais fácil e a fonte é relativamente mais estável e isentos de agentes patogénicos. Tomados em conjunto, o presente método descrito aqui pode ser usado para investigar o mecanismo relacionado da síntese de corticosterona em células adrenais fasciculata de rato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glândulas supra-renais desempenham um papel chave na adaptação ambiental3. O hormônio pelo qual o córtex adrenal secreta pode regular e ajustar as funções fisiológicas e homeostase3. O modelo in vivo reflete os efeitos fisiológicos real no corpo. No entanto, ainda é influenciado por muitos fatores complexos, causando efeitos instáveis em experimentos. Em contraste, o modelo de células in vitro tem vantagens que o torna incomparável para o modelo animal. Primeir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um subsídio da Taiwan Nacional de Conselho de ciência (NSC102-2320-B-037-008-MY3) e um Nacional Cheng Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
Materials
| female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| forceps | BRAUN | BD331R | |
| scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| inverted light microscopy | Leica | ||
| fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
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