Cultivo primario de células adrenocorticales rata y análisis de funciones Steroidogenic
Summary
La hormona secretada por la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. Aquí, presentamos un protocolo a la cultura la principal rata células suprarrenales. Podría ser una buena plataforma in vitro para investigar los mecanismos del reactivo de intereses de la esteroidogénesis suprarrenal y biosíntesis de lípidos.
Abstract
La hormona que segrega la corteza suprarrenal es vital para los animales contra el estrés y enfermedades. El método descrito aquí es el procedimiento de células suprarrenales primarios de rata cultivadas y ensayos funcionales relacionados (tinción de inmunofluorescencia de proteína superficial de la gota de lípidos, así como análisis de corticosterona). A diferencia de un modelo in vivo, la variación del interexperiments en cultivos monocapa suprarrenal es inferior y la condición experimental es fácil de controlar. Además, la fuente de las ratas también es más estable que otros animales, como bovinos. También hay varias líneas de células suprarrenales humanas (NCI-aviones usados H295 NCI-H295R, SW13, etc.) que pueden utilizarse en estudios suprarrenales. Sin embargo, la producción de esteroides de estas líneas todavía se verá afectada por numerosos factores, que incluyen el número de lote de suero, pasaje número, mutante, pérdida de genes distintos, etcetera. Excepción de falta de 17α-hidroxilasa, el cultivo primario de células adrenocorticales de rata es una técnica mejor y más conveniente para el estudio de fisiología suprarrenal. En Resumen, culturas suprarrenal de la rata principal podrían ser una buena plataforma in vitro por investigadores investigar los mecanismos del reactivo de interés en el sistema de la glándula suprarrenal.
Introduction
El sistema endocrino es responsable de la regulación de actividades fisiológicas y homeostasis1. Glándulas suprarrenales, situadas en el polo craneal de los riñones son uno de los principales órganos endocrinos que secretan mineralocorticoides, glucocorticoides y andrógenos2,3. Hay dos partes distintas de la glándula suprarrenal: la corteza y la médula. La corteza suprarrenal se compone de tres capas: la glomerulosa externa, fasciculada intermedia y los reticularis interno3. La zona glomerular es el sitio original de la secreción de la aldosterona, un mineralocorticoide, que ayuda en la reabsorción de iones de sodio y agua en los riñones3. La zona fasciculada produce principalmente un nivel basal de glucocorticoides en condiciones fisiológicas normales3. Corticosteroides en roedores y cortisol en los seres humanos actúan para ayudar al cuerpo para lidiar con el estrés mediante la regulación de la glucosa de sangre3. Hasta cierto punto, pueden inhibir las respuestas inflamatorias y regulan el sistema inmune4,5. A diferencia de otros mamíferos, ratones y ratas no tienen un reticularis de zona funcional debido a la falta de una expresión de 17α-hidroxilasa en la glándula suprarrenal6,7. Así, las glándulas suprarrenales de las ratas y ratones están desprovistas de la secreción de esteroides de C-19 suprarrenales (cortisol y andrógenos suprarrenales).
Primario las células adrenocorticales cultivadas han demostrado ser útiles para investigar los mecanismos que controlan la fisiología suprarrenal8. Como otros tejidos steroidogenic, cada zona suprarrenal sintetiza sus esteroides colesterol libre9. Sobre el estímulo de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH), el colesterol libre se libera de gotitas de lípidos de ruptura y, por lo tanto, mejora la producción de esteroides en el fasciculata y reticularis10.
Muchos grupos han tratado de establecer líneas celulares estables de carcinomas adrenocorticales. Sin embargo, varios problemas han limitado el uso de líneas de células adrenocorticales como en vitro modelos8. Las respuestas de esteroides de las líneas celulares pueden diferir entre pasajes, el número de lote de suero y la calidad del suero, etcetera. Por otra parte, líneas de células suprarrenales comercial (Y1 y SW13) no secretan de corticosterona, lo que es más difícil estudiar la esteroidogénesis suprarrenal8. Uso de bovinas y Equinas, las glándulas suprarrenales como ex vivo modelos pueden ser una buena opción, aunque los tejidos de estos mercados pueden ocultar algunos riesgos desconocidos. En comparación con ellos, dirigiendo las glándulas suprarrenales de rata es más fácil y la fuente es relativamente más estable y libre de patógenos. Tomados en conjunto, el presente método descrito aquí podría utilizarse para investigar el mecanismo relacionado de la síntesis de corticosterona en las células de fasciculada suprarrenal de rata.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las glándulas suprarrenales desempeñan un papel clave en la adaptación al medio3. La hormona que segrega la corteza suprarrenal puede regular y ajustar las funciones fisiológicas y homeostasis3. El modelo in vivo refleja los efectos fisiológicos reales en el cuerpo. Sin embargo, todavía está influenciada por muchos factores complejos, causando efectos inestables en experimentos. En contraste, el modelo de célula en vitro tiene ventajas que lo hace incomparable para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Taiwán de Consejo Nacional de ciencia (NSC102-2320-B-037-008-MY3) y una nacional Cheng Kung University Hospital beca de investigación (NCKUH-10102045).
Materials
| female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| forceps | BRAUN | BD331R | |
| scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| inverted light microscopy | Leica | ||
| fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
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