Primære kultur af rotte binyrebarkhormon celler og Assays af steroidogene funktioner
Summary
Det hormon, der udskilles af binyrebarken er afgørende for dyr mod stress og sygdomme. Vi præsenterer her, en protokol til kultur den primære rotte adrenal celler. Det kunne være en god in vitro-platform for at undersøge mekanismerne af reagens interesse for adrenal steroidogenesis og lipid biosyntesen.
Abstract
Det hormon, som binyrebarken udskiller er afgørende for dyr mod stress og sygdomme. Metoden beskrevet her er proceduren for primære kulturperler rotte adrenal celler og relaterede funktionelle assays (immunofluorescens farvning af lipid droplet overflade proteiner samt corticosterone analyse). I modsætning til en in vivo model, variation af interexperiments i adrenal éncellelag kulturer er mindre og den eksperimentelle betingelse er nemme at kontrollere. Desuden er kilde til rotter også mere stabil end andre dyr som kvæg ones. Der er også flere menneskelige adrenal cellelinjer (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.), der kan bruges i adrenal undersøgelser. Steroid produktion af disse linjer vil dog stadig påvirkes af mange faktorer, som omfatter serum lotnummer, passage nummer, mutant/tab af forskellige gener, osv. Bortset fra mangler 17α-hydroxylase, er den primære kultur af rotte binyrebarkhormon celler en bedre og mere bekvem teknik til at studere adrenal fysiologi. I Resumé, kan primære rotte adrenal kulturer være en god in vitro-platform for forskere at efterforske mekanismerne af reagens interesse i binyrerne system.
Introduction
Det endokrine system er ansvarlig for at regulere fysiologiske aktiviteter og homøostase1. Binyrerne ligger på den kranielle pol i nyrerne er en af de største endokrine organer, som udskiller mineralkortikoider og glukokortikoider androgen2,3. Der er to adskilte dele af binyrerne: cortex og medulla. Binyrebarken består af tre lag: den ydre glomerulosa, den mellemliggende fasciculata og indre reticularis3. Zona glomerulosa er den oprindelige secernerende af aldosteron, en mineralocorticoid, som aids i reabsorbing natrium ion og vand i nyrerne3. Zona fasciculata producerer primært en basal grad af glukokortikoider i normale fysiologiske forhold3. Kortikosteroider i gnavere og cortisol hos mennesker handle for at hjælpe kroppen med at klare stress ved at regulere blod glucose3. Til en vis grad kan hæmme inflammatoriske respons og regulere immunsystemet4,5. I modsætning til andre pattedyr, mus og rotter ikke har en funktionel zona reticularis på grund af manglen på en 17α-hydroxylase udtryk i binyrerne6,7. Binyrer fra mus og rotter er således blottet for udskillelsen af adrenal C-19 steroider (kortisol og adrenale androgener).
Primære kulturperler binyrebarkhormon celler har vist sig at være nyttige for efterforskningen mekanismer kontrollerende adrenal fysiologi8. Ligesom andre steroidogene væv syntetiserer hver adrenal zone sin steroider fra gratis kolesterol9. Ved adrenocorticotropt (ACTH) hormonstimulation, gratis kolesterol slippes fra fordelingen lipid dråber, og dermed forbedrer steroid produktion i fasciculata og reticularis10.
Mange grupper har forsøgt at etablere stabile cellelinjer fra binyrebarkhormon karcinomer. Men flere bekymringer har begrænset brug af binyrebarkhormon cellelinjer som in vitro modeller8. De steroid svar af cellelinjer kan variere mellem passager, lotnummeret for serum og kvaliteten af serum, osv. Derudover udskiller kommercielle adrenal cellelinjer (Y1 og SW13) ikke corticosteron, hvilket gør det vanskeligere at studere adrenal steroidogenesis8. Ved hjælp af kvæg og enhovede dyr binyrer som ex vivo modeller kan være et godt valg, selvom væv fra disse markeder kan sløre nogle ukendte risici. Sammenlignet med dem, forvaltningen af rotte binyrerne er lettere og kilden er relativt mere stabil og patogenfrie. Tilsammen, kunne den nuværende metode beskrevet her bruges til at undersøge den relaterede mekanisme af corticosterone syntese i rotte adrenal fasciculata celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Binyrerne spiller en nøglerolle i miljømæssig tilpasning3. Hormon som binyrebarken udskiller kan regulere og justere fysiologiske funktioner og homøostase3. In vivo modellen afspejler de reelle fysiologiske virkninger i kroppen. Det er dog stadig påvirket af mange komplicerede faktorer, forårsager ustabilt effekter i eksperimenter. Derimod har in vitro celle model fordele som gør det mageløse dyr model. Først, den miljømæssige tilstand er nemme at kontrollere i i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Science Rådet Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) og nationale Cheng Kung University Hospital forskning tilskud (NCKUH-10102045).
Materials
| female/ male, SD/Wistar rats (8-12 wk) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/ml) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| forceps | BRAUN | BD331R | |
| scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| inverted light microscopy | Leica | ||
| fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H., Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. , 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. . Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I. Cytokines and steroidogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. (1-2), 135-141 (2004).
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O’Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
