Isolatie en adoptief overdracht van hoge zout behandeld antigeen-presenteren dendritische cellen

Summary

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van dendritische cellen uit lymfkliertest milt door magnetische cel Sorteren en latere adoptief overdracht naïef muizen. Het model van hoge-zout geactiveerde dendritische cellen werd gekozen om de stapsgewijze procedures voor de overdracht van de geadopteerde en stroom cytometry uitleggen.

Abstract

Teveel zout inname bijdraagt tot ontsteking en speelt een vitale rol in de ontwikkeling van hypertensie. Eerder vonden we dat antigeen-presenteren dendritische cellen (DC’s) verhoogde extracellulaire natrium leidt tot het activeren van de NADPH oxidase en vorming van isolevuglandin (IsoLG) kunnen zin-eiwit adducten. Deze IsoLG-eiwit adducten reageren met zelf-eiwitten en een auto-immune-achtige toestand en hypertensie bevorderen. Wij hebben ontwikkeld en geoptimaliseerd state-of-the-art methoden om te bestuderen van DC functie in hypertensie. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor isolatie, in vitro behandeling met de verhoogde natrium en adoptief overdracht van lymfkliertest milt CD11c⁺ cellen in ontvangende muizen te bestuderen van hun rol in hypertensie.

Introduction

Overtollige dieet zout is een belangrijke risicofactor voor hoge bloeddruk. ^{1 , 2} the American Heart Association adviseert een maximum van 2.300 milligram (mg), natrium (Na⁺) inname per dag, echter; minder dan 10% van de Amerikaanse bevolking merkt deze aanbeveling. ^{3 , 4} bescheiden verlaging van de⁺ Na inname de bloeddruk verlagen en de jaarlijkse nieuwe gevallen van hart-en vaatziekten en beroerte in de VS met 20% verminderen. ⁵ een groot probleem met overmatige consumptie van zout is dat 50% van de bevolking van hypertensieve zout-gevoeligheid vertoont, gedefinieerd als een stijging van de bloeddruk Na⁺ laden of een gelijkaardige daling van de bloeddruk na na Na^{met 10 mmHg +} beperking en diurese. ⁶ zout-gevoeligheid ook optreedt in 25% van de normotensive personen, en is een onafhankelijke voorspeller van dood en cardiovasculaire gebeurtenissen. ^{7 , 8} zout-sensing mechanismen in hypertensie waarbij de nieren zijn goed bestudeerd; recente studies suggereren echter dat de immuuncellen nb⁺kunnen voelen. ^{9 , 10}

Recent bewijs suggereert dat veranderingen in extra renale nb⁺ behandeling kunnen leiden ophoping van nb⁺ in het interstitium tot en bevordering van ontsteking. ^{11 , 12} ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat de cellen van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem aan de verergering van hypertensie bijdragen. ^{9 , 13 , 14 , 15} verschillende hypertensieve stimuli, met inbegrip van angiotensine II, noradrenaline en zout oorzaak macrofagen, monocyten en T-lymfocyten infiltreren de nier- en therapieën te bevorderen nb⁺ retentie, vasoconstrictie, bloeddruk hoogte en einde-orgel schade. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} in voorafgaande studies, vonden we dat DCs isolevuglandin (IsoLG accumuleren)-eiwit adducten in reactie op verschillende stimuli van hypertensieve met inbegrip van angiotensine II en DOCA-zout hypertensie. ¹⁴ IsoLGs zijn zeer reactieve producten van lipide peroxidatie die snel en covalent te lysines op eiwitten adduct en hun accumulatie wordt geassocieerd met DC activering. ¹⁴ we hebben onlangs vastgesteld dat verhoogde nb⁺ een krachtige stimulans voor IsoLG-eiwit is adduct vorming in RattenUitrustingen DCs.⁹ nb⁺ inwerkingtreding DCs is bemiddeld door amiloride gevoelige vervoerders. NB⁺ wordt vervolgens omgewisseld voor calcium (Ca^{2 +}) via de nb⁺/CA^{2 +} warmtewisselaar. CA^{2 +} wordt geactiveerd proteïne kinase, C (PKC) die activeert de NADPH oxidase leidt tot verhoogde superoxide (O₂^{· –}) en IsoLG-eiwit adduct vorming. ⁹ adoptief overdracht van zout-blootgesteld DCs priemgetallen hypertensie in reactie op een sub pressor dosis van angiotensine II. ⁹

Identificatie van CD11c⁺ DCs uit weefsels is eerder beperkt immunohistochemistry en RT-PCR, en isolatie van DCs is beperkt tot de cel Sorteren op stroom cytometry. Hoewel stroom cytometry cel Sorteren een krachtige methode voor de isolatie van immune cellen is, het is duur, tijdrovend, en leidt tot een lage rendement van levensvatbare cellen. Daarom hebben we een stap voor stap-protocol voor het weefsel spijsvertering, in vitro stimulatie en adoptief overdracht van CD11c geoptimaliseerd⁺ DCs te bestuderen van hypertensie.

Protocol

Vanderbilt University’s institutionele Animal Care en gebruik Comité hebben de hierin beschreven procedures goedgekeurd. Muizen zijn gehuisvest en verzorgd volgens de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren (National Academies Press. Herziene 2010). 1. isolatie van milt van muizen Bereiden 1640 RPMI: 10% FBS, 0.10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvaat, 50 µM β-mercaptoethanol en 1% penicilline/streptomycine. Euthanaseren van 10 – 12 week-oude C57bl/6 manneli…

Representative Results

Figuur 1 geeft een schematische voorstelling van de hierboven beschreven stappen. Geïsoleerde lymfkliertest milt worden gesorteerd voor CD11c+ DCs door magnetische cel Sorteren en vergulde in normale zout media (NS; 150 mmol NaCl) of hoog zout media (HS; 190 mmol NaCl) voor 48 h. CD11c+ DCs worden vervolgens adoptively overgedragen door retro-orbitaal injectie te naïef ontvangende muizen. Tien dagen later, de muizen zijn geïmplanteerd…

Discussion

In het huidige protocol, hebben we procedures om te isoleren CD11c geoptimaliseerd⁺ DCs van milt van muizen en adoptively ze vervolgens overbrengen naar naïeve dieren te bestuderen van de rol van DCs in zout-geïnduceerde hypertensie. Dit protocol kan worden aangepast om te isoleren en adoptively overdracht andere immuun cel subsets met inbegrip van macrofagen, monocyten en adaptieve immune cellen, met inbegrip van T en B-lymfocyten. We hebben de milt spijsverteringsproces om voldoende cel overleving en stabi…

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030