Isolation und Adoptiveltern Übertragung von hohen Salz behandelt Antigen-präsentierende dendritische Zellen

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur dendritische Zellen aus murinen Milz von magnetischen Zellsortierung und späteren Adoptiveltern Übertragung ins naive Mäuse zu isolieren. Das Modell von hohem Salzgehalt aktivierten dendritischen Zellen wurde gewählt, um die schrittweisen Verfahren Adoptiv-Transfer und Durchflusszytometrie zu erklären.

Abstract

Überschüssiges Salz Nahrungsaufnahme trägt zur Entzündung und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Bluthochdruck. Zuvor fanden wir, dass Antigen-präsentierende dendritische Zellen (DCs) spürt erhöhte extrazelluläre Natrium führt die Aktivierung von der NADPH-Oxidase und Bildung von Isolevuglandin (IsoLG)-Protein-Addukte. Diese IsoLG-Protein Addukte mit selbst-Proteine reagieren und fördern eine Autoimmun-artigen Zustand und Bluthochdruck. Wir haben entwickelt und optimiert, State-of-the-Art Methoden, um DC Funktion bei Hypertonie zu untersuchen. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung Vitro Behandlung mit erhöhten Natrium- und Adoptiveltern Übertragung der murinen Milz CD11c⁺ Zellen in Empfänger Mäuse, ihre Rolle bei der Hypertonie zu studieren.

Introduction

Überschüssige diätetische Salz ist ein wichtiger Risikofaktor für Bluthochdruck. ^{1 , 2} the American Heart Association empfiehlt maximal 2.300 Milligramm (mg) Natrium (Na⁺)-Zufuhr pro Tag, jedoch; weniger als 10 % der US-Bevölkerung beobachtet diese Empfehlung. ^{3 , 4} bescheidene Reduzierung der Na⁺ Einnahme Blutdruck senken und die jährliche neue Fälle von koronarer Herzkrankheit und Schlaganfall in den USA um 20 % reduzieren. ⁵ ist ein großes Problem mit überschüssiger Salzverbrauch, dass 50 % der Bevölkerung Hypertensive Salz-Empfindlichkeit aufweist definiert als Anstieg des Blutdrucks, Na^{Na+ laden oder ein ähnlicher Rückgang der Blutdruck nach 10 MmHg +} Einschränkung und Diurese. ⁶ Salz-Empfindlichkeit auch bei 25 % der normotonen Personen, und ist ein unabhängiger Prädiktor für Tod und kardiovaskuläre Ereignisse. ^{7 , 8} Salz-sensing Mechanismen bei Hypertonie unter Einbeziehung der Niere sind gut untersucht worden; Neuere Studien legen jedoch nahe, dass Immunzellen Na⁺spüren können. ^{9 , 10}

Neuer Beweis schlägt vor, dass Änderungen in extra renal Na⁺ Umgang mit Anhäufung von Na⁺ in das Interstitium verursachen und Entzündung fördern können. ^{11 , 12} unser Labor und andere haben gezeigt, dass Zellen der angeborenen und der adaptiven Immunsystems, die Verschärfung von Bluthochdruck beitragen. ^{9 , 13 , 14 , 15} verschiedene Hypertensive Reize, einschließlich Angiotensin II, Noradrenalin und Salz Ursache Makrophagen, Monozyten und T-Lymphozyten zu infiltrieren, Nieren- und Gefäßsystem Na⁺ Aufbewahrung, Vasokonstriktion, Blutdruck Höhe und Ende Organschäden. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} in früheren Studien, wir fanden, dass DCs Isolevuglandin (IsoLG) ansammeln-Protein-Addukte als Reaktion auf verschiedene Hypertensive Reize einschließlich Angiotensin II und DOCA-Salz Bluthochdruck. ¹⁴ IsoLGs sind hochreaktive Produkte der Lipidperoxidation, die schnell und kovalent, Lysines auf Proteine Addukt und ihre Ansammlung DC Aktivierung zugeordnet ist. ¹⁴ wir haben vor kurzem festgestellt, dass erhöhte Na⁺ einen potenten Reiz für IsoLG-Protein Addukt Bildung in Murine, die DCs.⁹ Na⁺ Inkrafttreten DCs durch Amilorid sensible Transporter vermittelt wird. Na⁺ ist dann für Kalzium (Ca^{2 +}) über die Na⁺/Ca^{2 +} Wärmetauscher ausgetauscht. Ca^{2 +} aktiviert Proteinkinase C (PKC), die NADPH-Oxidase führt zu erhöhten Superoxid (O₂^{· –}) aktiviert, und IsoLG-Protein Addukt Bildung. ⁹ Adoptiv Übertragung von Salz ausgesetzt DCs Primzahlen Hypertonie als Reaktion auf eine Sub-Druckluftstationen Dosis von Angiotensin II. ⁹

Identifizierung von CD11c⁺ DCs aus Geweben wurde bisher begrenzt Immunohistochemistry und RT-PCR, und Isolierung von DCs wurde beschränkt auf Zelle Sortierung nach Durchflusszytometrie. Obwohl Flow Cytometry Zellsortierung eine leistungsfähige Methode für die Isolierung von Immunzellen ist, es ist teuer, zeitaufwendig und führt zu einer geringen Ausbeute von entwicklungsfähigen Zellen. Deshalb haben wir eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für Gewebe Verdauung, in-vitro-Stimulation und Adoptiveltern Übertragung von CD11c optimiert⁺ DCs, Bluthochdruck zu studieren.

Protocol

Vanderbilt University institutionelle Animal Care und Use Committee haben die hier beschriebenen Verfahren zugestimmt. Mäuse sind untergebracht und betreut gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (National Academies Press. Überarbeitete 2010). 1. Isolierung der Milz von Mäusen Bereiten Sie RPMI 1640: 10 % FBS, 0,10 mM HEPES, 1 mM Natrium Pyruvat, 50 µM β-Mercaptoethanol und 1 % Penicillin/Streptomycin. 10 – 12 Wochen einschläfern-alte C5…

Representative Results

Abbildung 1 stellt eine schematische Darstellung der oben beschriebenen Schritte. Isolierte murinen Milz sind für CD11c sortiert+ DCs durch magnetische Zelle sortieren und vergoldet in entweder normales Salz (NS; 150 Mmol NaCl) oder hohen Salz Medien (HS; 190 Mmol NaCl) für 48 h CD11c+ DCs werden dann mit einem Retro-Orbital adoptively übertragen Injektion zu naive Empfänger Mäuse. Zehn Tage später, werden Mäuse mit osmotischen Mi…

Discussion

In das aktuelle Protokoll haben wir Verfahren zur Isolierung von CD11c optimiert⁺ DCs aus der Milz von Mäusen und adoptively in naiven Tiere zur Untersuchung der Rolle von DCs in Salz-induzierte Hypertonie überführen. Dieses Protokoll kann angepasst zu isolieren und andere Immunzellen Teilmengen einschließlich adaptive Immunzellen einschließlich T- und B-Lymphozyten, Makrophagen und Monozyten adoptively übertragen werden. Wir haben die Milz Verdauungsprozess zur Erreichung angemessener Zelle überleben u…

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030