Изоляции и приемных передачи высоких соли лечить антиген представляя дендритные клетки
Summary
Здесь мы представляем протокол изолировать дендритные клетки из мышиных селезенки магнитные ячейку Сортировка и последующих приемных передачи в наивной мышей. Чтобы объяснить шаг за шагом процедуры приемных передачи и проточной цитометрии была выбрана модель высоким соли активированные дендритных клеток.
Abstract
Избыток соли рацион способствует воспаление и играет жизненно важную роль в развитии артериальной гипертензии. Ранее мы обнаружили, что антиген представляя дендритных клеток (DCs) может смысле повышенных внеклеточного натрия приводит к активации NADPH оксидаза и формирование isolevuglandin (IsoLG)-аддуктов протеин. Эти IsoLG белка аддукты реагируют с self белки и поощрения государственных аутоиммунных как и гипертонии. Мы разработали и оптимизированы-современных методов для изучения функции DC в гипертензии. Здесь, мы предоставляем подробный протокол для изоляции, в vitro лечение с повышенными натрия и приемных передачи мышиных селезеночной CD11c+ клеток в получателей мышей, чтобы изучить их роль в гипертензии.
Introduction
Избыток пищевой соли является одним из основных факторов риска гипертонии. 1 , 2 американской ассоциации сердца рекомендует более 2300 миллиграммов (мг) потребления натрия (Na+) в день, однако; менее 10% населения США отмечает эту рекомендацию. 3 , 4 скромные сокращения потребления Na+ снизить кровяное давление и уменьшить ежегодный новых случаев ишемической болезни сердца и инсульта в США на 20%. 5 основная проблема избыточного потребления поваренной соли является, что 50% из населенности гипертонической exhibits соли чувствительность, определяется как 10 мм ртутного столба, увеличение артериального давления после загрузки Na+ или же падение артериального давления после Na+ ограничения и диурез. 6 соли чувствительность также происходит в 25% нормотензивной лиц и является независимым предиктором смерти и сердечно-сосудистых событий. 7 , 8 соли зондирования механизмов с участием почечной гипертонии хорошо изучены; Однако последние исследования показывают, что иммунные клетки могут смысле Na+. 9 , 10
Последние данные свидетельствуют о том, что изменения в экстра почечной Na+ обработка может вызвать накопление Na+ в интерстиции и содействовать воспаления. 11 , 12 нашей лаборатории и другие показали, что клетки врожденная и адаптивного иммунитета способствовать обострению гипертонии. 9 , 13 , 14 , 15 различных гипертонической стимулы, включая ангиотензина II, норадреналина и соли причиной макрофагов, моноцитов и лимфоцитов T для проникновения в почках и сосудистую и поощрения удержания Na+ , сужение сосудов, кровяное давление Высота над уровнем моря и конец орган ущерб. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 в предыдущих исследований, мы обнаружили, что DCs накапливать isolevuglandin (IsoLG)-белок аддукты в ответ на различные стимулы гипертонический, включая ангиотензина II и дока соль гипертонии. 14 IsoLGs Высокореактивная продуктов перекисного окисления липидов, которые быстро и ковалентно аддукт с lysines белков и их накопление связан с активацией DC. 14 недавно мы установили, что повышенные Na+ является мощным стимулом для IsoLG белка аддукт формирования в мышиных, которую DCs.9 Na+ вступления в DCs опосредуется через Амилорид чувствительных перевозчиков. Na+ затем обменять на кальция (Ca2 +) через ЦС2 + обменник Na+. CA2 + активирует протеинкиназы C (PKC) который активирует NADPH оксидаза, ведущих к увеличению супероксида (O2· –) и IsoLG белка аддукт формирования. 9 приемных передачи соли облученных DCs воспламеняет гипертензии в ответ к югу прессорных доза ангиотензина II. 9
Выявление CD11c+ РС из тканей ограничивалась ранее иммуногистохимии и RT-PCR и изоляции РС была ограничена ячейку Сортировка по проточной цитометрии. Хотя поток цитометрии сортировки клеток является мощный метод для изоляции иммунных клеток, он является дорогостоящим, требует много времени и приводит к низкой доходности жизнеспособных клеток. Таким образом, мы оптимизировали протокол шаг за шагом ткани пищеварение, в пробирке стимуляции и приемных передачи CD11c+ DCs для изучения гипертонии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В текущем протоколе, мы оптимизировали процедуры изолировать CD11c+ РС из селезенки мышей и восприимчивую перенести их в наивной животных для изучения роли контроллеров домена в Солт индуцированной гипертонии. Этот протокол может быть адаптирована для изоляции и восприимчивую пер…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана американская ассоциация сердца предоставляет POST290900 N.R.B., 17SDG33670829, экспериментальная и национальных институтов здравоохранения предоставить K01HL130497 а.к.
Materials
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use protocol: Spleen 04.01 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835-030 |
References
- Kearney, P. M., et al. Global burden of hypertension: analysis of worldwide data. Lancet. 365, 217-223 (2005).
- Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N Engl J Med. 369, 448-457 (2013).
- Lev-Ran, A., Porta, M. Salt and hypertension: a phylogenetic perspective. Diabetes/metabolism research and reviews. 21, 118-131 (2005).
- Frisoli, T. M., Schmieder, R. E., Grodzicki, T., Messerli, F. H. Salt and hypertension: is salt dietary reduction worth the effort. The American journal of medicine. 125, 433-439 (2012).
- He, F. J., Li, J., Macgregor, G. A. Effect of longer-term modest salt reduction on blood pressure. Cochrane Database Syst Rev. 4, 004937 (2013).
- Weinberger, M. H., Miller, J. Z., Luft, F. C., Grim, C. E., Fineberg, N. S. Definitions and characteristics of sodium sensitivity and blood pressure resistance. Hypertension. 8, 127-134 (1986).
- Morimoto, A., et al. Sodium sensitivity and cardiovascular events in patients with essential hypertension. Lancet. 350, 1734-1737 (1997).
- Weinberger, M. H., Fineberg, N. S., Fineberg, S. E., Weinberger, M. Salt sensitivity, pulse pressure, and death in normal and hypertensive humans. Hypertension. 37, 429-432 (2001).
- Barbaro, N. R., et al. Dendritic Cell Amiloride-Sensitive Channels Mediate Sodium-Induced Inflammation and Hypertension. Cell Rep. 21, 1009-1020 (2017).
- Kirabo, A. A new paradigm of sodium regulation in inflammation and hypertension. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 313, 706-710 (2017).
- Machnik, A., et al. Macrophages regulate salt-dependent volume and blood pressure by a vascular endothelial growth factor-C-dependent buffering mechanism. Nat Med. 15, 545-552 (2009).
- Kopp, C., et al. 23Na magnetic resonance imaging-determined tissue sodium in healthy subjects and hypertensive patients. Hypertension. 61, 635-640 (2013).
- Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 312, 368-374 (2017).
- Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. J Clin Invest. 124, 4642-4656 (2014).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, immunity, and hypertensive end-organ damage. Circ Res. 116, 1022-1033 (2015).
- Harrison, D. G., Vinh, A., Lob, H., Madhur, M. S. Role of the adaptive immune system in hypertension. Curr Opin Pharmacol. 10, 203-207 (2010).
- Madhur, M. S., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55, 500-507 (2010).
- Harrison, D. G., et al. Inflammation, immunity, and hypertension. Hypertension. 57, 132-140 (2011).
- Crowley, S. D., et al. Stimulation of lymphocyte responses by angiotensin II promotes kidney injury in hypertension. American journal of physiology. Renal physiology. 295, 515-524 (2008).
- Zhang, J. D., et al. A novel role for type 1 angiotensin receptors on T lymphocytes to limit target organ damage in hypertension. Circ Res. 110, 1604-1617 (2012).
