절연 및 높은 소금의 입양 전송 처리 수지상 세포를 항 원 제시

Summary

여기, 선물이 자기 세포 분류와 순진한 쥐로 후속 입양 전송 murine spleens에서 수지상 세포를 분리 하는 프로토콜. 높은 소금 활성화 수지상 세포의 모델 입양 전송 및 cytometry의 단계별 절차를 설명 하기 위해 선택 되었다.

Abstract

초과 규정식 소금 입구 염증에 기여 하 고 고혈압의 개발에 중요 한 역할을 한다. 우리는 이전 수지상 세포 항 원 선물 (DCs) 높은 extracellular 나트륨 NADPH 산화 효소의 활성화 및 isolevuglandin (IsoLG)의 형성을 느낄 수 있다 발견-단백질 adducts. 이러한 IsoLG 단백질 adducts 자기 단백질 반응 고 상태 처럼 자가 면역 질환 및 고혈압. 우리가 개발 하 고 고혈압에 DC 기능 연구-의 상태–예술 방법 최적화. 여기, 상세한 프로토콜을 제공 격리에서 높은 나트륨와 murine 비장 CD11c 입양 이전 체 외 치료 고혈압에 그들의 역할을 공부 하는 받는 사람 쥐로⁺ 세포.

Introduction

식이 과잉 소금은 고혈압에 대 한 주요 위험 요소. ^{1 , 그러나 2} 미국 심장 협회 권장 최대 2300 밀리 그램 (mg)의 하루 나트륨 (Na⁺) 섭취; 미국 인구의 10% 미만 관찰이 추천. ^{3 , 4} 나⁺ 입구에 있는 겸손 한 감소 혈압을 낮출 하 고 20%로 관상 동맥 심장 질환과 뇌졸중은 미국에서의 매년 새로운 사례를 감소. ⁵ 과잉 소금 소비와 주요 문제는 고혈압 인구의 50% 소금 감도, 전시 나⁺ 로드 또는 혈압에 비슷한 드롭 없음^{후 다음 혈압에서 10 mmHg 증가 정의 +} 제한 및 diuresis. ⁶ 소금 감도 또한 normotensive 개인의 25%에서 발생 하 고 심장 혈관 사건 및 죽음의 독립적인 예측 이다. ^{7 , 8} 소금 감지 메커니즘 신장과 관련 된 고혈압에 잘 공부 되었다; 그러나, 최근 연구는 면역 세포 나⁺을 느낄 수 있다 건의 한다. ^{9 , 10}

최근의 증거는 여분 신장 Na⁺ 에 변경 처리는 interstitium에 나⁺ 의 축적을 일으킬 수 있으며 염증 촉진 제안 합니다. ^{11 , 12} 우리의 실험실과 다른 사람으로 나타났습니다 모두 타고 난 및 적응형 면역 체계의 세포 고혈압의 악화에 기여. ^{9 , 13 , 14 , 15} 다양 한 성 자극, angiotensin II, 노르, 그리고 소금 원인 세포, monocytes 그리고 신장, 맥 관 구조에 침투 나⁺ 보존, vasoconstriction, 혈압을 추진 하 고 T 림프 톨을 포함 하 여 고도 고 끝-장기 손상입니다. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} 이전 연구에서 우리는 발견 Dc isolevuglandin (IsoLG) 축적-단백질 adducts angiotensin II 및 DOCA 소금 고혈압을 포함 한 다양 한 성 자극에 대 한 응답에서. ¹⁴ IsoLGs lysines 단백질에 게 신속 하 고 covalently adduct 지질 과산화의 반응성이 매우 높은 제품 이며 그들의 축적은 DC 활성화와 관련. 우리는 최근 높은 Na⁺ IsoLG 단백질에 대 한 강력한 자극은 설립 ¹⁴ adduct에 Dc에 Dc.⁹ 나⁺ 항목은 amiloride 민감한 전송기를 통해 중재 murine 형성. 나⁺ Na⁺/Ca^{2 +} 교환기를 통해 칼슘 (캘리포니아^{2 +})에 대 한 다음 교환 됩니다. 캘리포니아^{2 +} 활성화 단백질 키 니 아 제 C (PKC) 증가 초과 (₂O^·-)로 이어지는 NADPH 산화 효소를 활성화 하 고 IsoLG 단백질 adduct 형성. ⁹ 응답 angiotensin II의 하위 pressor 복용량으로 Dc 소수 고혈압 소금 노출의 입양 양도. ⁹

CD11c의⁺ Dc 조직에서 이전 immunohistochemistry RT-PCR, 제한 되었으며 Dc의 절연 cytometry 정렬 셀으로 제한 되었습니다. 교류 cytometry 셀 정렬 면역 세포의 고립에 대 한 강력한 방법 이지만, 값이 비싼, 시간이 걸리는, 이며 실행 가능한 세포의 낮은 수익률을 리드. 따라서, 우리 조직 소화, 생체 외에서 자극 및 CD11c의 입양 전송 단계 프로토콜 최적화⁺ 고혈압 연구 Dc.

Protocol

밴 더 빌 트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 여기에 설명 된 절차를 승인 했습니다. 마우스는 보관 및 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박 가이드에 대 한 걱정. 수정된 2010)입니다. 1입니다. 마우스에서 Spleens의 격리 1640 RPMI 준비: 10 S, 0.10 mM HEPES, 1mm 나트륨 pyruvate, 50 µ M β-mercaptoethanol와 1% 페니실린/스. 10-12 주를 안락사-오래 된 공동2 …

Representative Results

그림 1 설명 단계 위의 회로도를 나타냅니다. 절연된 murine spleens CD11c 정렬 됩니다+ 마그네틱 셀 정렬 및 48 h. CD11c 일반 소금 미디어 (NS; 150 mmol NaCl) 또는 높은 소금 미디어 (HS; 190 mmol NaCl) 도금에 의해 Dc+ Dc 복고풍 궤도 adoptively 전송한 다음 순진한 받는 사람 쥐 하는 주입 10 일 후, 마우스는 14 일에 대 한 낮은 복용량 angiotensin II (140 ng/kg/…

Discussion

현재 프로토콜에서 우리 CD11c 분리 하는 절차를 최적화⁺ Dc spleens 마우스 및 adoptively에서 순진한 동물 소금 유발 고혈압에 Dc의 역할을 연구 하기에 그들을 전송. 이 프로토콜은 격리 하 고 adoptively 대 식 세포, T와 B 림프 톨을 포함 하 여 적응 면역 세포, monocytes, 등 다른 면역 세포 하위 집합을 전송 적용할 수 있습니다. 우리는 적절 한 세포 생존 및 DC 표면 식 마커의 안정성 비장 소화 프로세…

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium	Gibco	11835-030