Aislamiento y la transferencia adoptiva de sal alta tratan células dendríticas presentadoras de antígenos
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para aislar las células dendríticas de bazos murinos por clasificación magnética celular y posterior transferencia adoptiva en ratones ingenuos. El modelo de células dendríticas activadas de sal fue elegido para explicar los procedimientos paso a paso de transferencia adoptiva y citometría de flujo.
Abstract
La ingesta de sal excesiva contribuye a la inflamación y desempeña un papel vital en el desarrollo de la hipertensión arterial. Hemos encontrado que presentadoras de antígeno células dendríticas (DCs) pueden detectar sodio extracelular elevado conduce a la activación de la NADPH oxidasa y la formación de isolevuglandin (IsoLG)-aductos de proteínas. Estas proteínas IsoLG aductos reaccionan con proteínas de uno mismo y promover un estado autoinmune y la hipertensión. Hemos desarrollado y optimizado métodos de vanguardia para estudiar la función de DC en la hipertensión arterial. Presentamos un protocolo detallado para el aislamiento, en vitro tratamiento con sodio elevado y transferencia adoptiva de CD11c esplénicos murinos+ células en ratones receptores para estudiar su papel en la hipertensión arterial.
Introduction
Exceso de sal dietético es un factor de riesgo para la hipertensión. 1 , 2 la Asociación Americana del corazón recomienda un máximo de 2.300 miligramos (mg) de ingesta de sodio (Na+) por día, sin embargo; menos del 10% de la población de Estados Unidos observa esta recomendación. 3 , 4 reducciones moderadas en la ingesta de Na+ bajan la presión arterial y reducen los nuevos casos anuales de enfermedad coronaria y accidente cerebrovascular en los Estados Unidos en un 20%. 5 un gran problema con el consumo excesivo de sal es que 50% de la población hipertensa presenta sensibilidad a la sal, definida como un aumento de 10 mmHg en la presión arterial tras NaNa+ carga o una caída similar en la presión arterial + la diuresis y restricción. 6 sensibilidad a la sal también se produce en el 25% de los individuos normotensos y es un predictor independiente de muerte y eventos cardiovasculares. 7 , 8 mecanismos de detección de sal en la hipertensión con el riñón han sido bien estudiados; sin embargo, estudios recientes sugieren que las células inmunes pueden sentir Na+. 9 , 10
La evidencia reciente sugiere que cambios en extra renal Na+ manipulación pueden causar acumulación de Na+ en el intersticio y promover la inflamación. 11 , 12 nuestro laboratorio y otros han demostrado que las células del sistema inmunitario tanto innato y adaptativo contribuyen a la exacerbación de la hipertensión arterial. 9 , 13 , 14 , 15 varios estímulos de hipertensos, como la angiotensina II, norepinefrina y causa sal macrófagos, monocitos y linfocitos T que infiltran el riñón y vasculatura y promover la retención de Na+ , vasoconstricción, hipertensión elevación y daño de órganos. 9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 en estudios anteriores, encontramos que los DCs acumulan isolevuglandin (IsoLG)-proteína aductos en respuesta a diversos estímulos de hipertensos incluyendo angiotensina II e DOCA sal hipertensión. 14 IsoLGs son altamente reactivos productos de peroxidación lipídica que rápidamente y covalente aducción a lisinas en proteínas y su acumulación se asocia con la activación de la DC. 14 recientemente hemos establecido que elevado Na+ es un estímulo potente para la proteína IsoLG aducción formación murine DCs.9 Na+ entrar DCs es mediada por transportadores sensible amilorida. Na+ entonces se intercambia para el calcio (Ca2 +) vía el /Ca2 + intercambiador de Na+. CA2 + activa la proteína quinasa C (PKC) que activa la NADPH oxidasa lleva a mayor superóxido (O2· –) y proteína IsoLG aducción formación. 9 transferencia adoptiva de hipertensión de primos de DCs sal expuestos en respuesta a una dosis sub-presor de la angiotensina II. 9
Identificación de CD11c+ DCs de tejidos ha sido previamente limitada a la inmunohistoquímica y RT-PCR y aislamiento de DCs se ha limitado a ordenar por citometría de flujo de la célula. Aunque flujo citometría celular clasificación es un método eficaz para el aislamiento de las células inmunes, es costoso, desperdiciador de tiempo y conduce a una baja producción de células viables. Por lo tanto, nos hemos optimizado un protocolo paso a paso para la digestión de tejido, estimulación in vitro y transferencia adoptiva de CD11c+ DCs para el estudio de la hipertensión.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el protocolo actual, hemos optimizado los procedimientos para aislar CD11c+ DCs de bazos de ratones y eventualmente transferirlos en ingenuos animales para estudiar el papel de la DCs en la hipertensión inducida por la sal. Este protocolo puede ser adaptada para aislar y eventualmente transferir otros subconjuntos de células inmunes como macrófagos, monocitos y células inmunitarias adaptativas incluyendo los linfocitos T y B. Hemos optimizado el proceso de digestión esplénico para lograr la superviven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por American Heart Association otorga POST290900 N.R.B., 17SDG33670829 L.X. y institutos nacionales de salud otorgar K01HL130497 a A.K.
Materials
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117324 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| CD11c MicroBeads Ultrapure | Miltenyi Biotec | 130-108-338 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| FITC anti-mouse CD45 | Biolegend | 103108 | |
| GentleMACS C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use protocol: Spleen 04.01 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Invitrogen | L34964 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACs Seperator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11835-030 |
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