Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein experimentelles Protokoll zur Bewertung der morphologischen Eigenschaften und des Funktionellen Status von Bandsynapsen bei normalen Mäusen. Das vorliegende Modell eignet sich auch für lärminduzierte und altersbedingte Cochlea-Synaptopathie-eingeschränkte Modelle. Die korrelativen Ergebnisse früherer Mausstudien werden ebenfalls diskutiert.
Abstract
Cochlea-Innenhaarzellen (IHCs) übertragen akustische Signale über Bandsynapsen an Spiralganglionneuronen (SGNs). Mehrere experimentelle Studien haben gezeigt, dass Haarzellsynapsen die ersten Ziele bei sensorineuralem Hörverlust (SNHL) sein können. Solche Studien haben das Konzept der Cochlea “Synaptopathie” vorgeschlagen, die sich auf Veränderungen der Bandsynapse Zahl, Struktur oder Funktion, die in abnormale synaptische Übertragung zwischen IHCs und SGNs führen bezieht. Während Cochlea-Synaptopathie irreversibel ist, wirkt sie sich nicht auf die Hörschwelle aus. In lärminduzierten Versuchsmodellen wird eine eingeschränkte Schädigung von IHC-Synapsen in ausgewählten Frequenzregionen eingesetzt, um die Umweltfaktoren zu identifizieren, die speziell Synaptopathie verursachen, sowie die physiologischen Folgen der Störung dieses Innenohrs. bahn. Hier stellen wir ein Protokoll zur Analyse der synaptischen Morphologie und Funktion der Cochlea-Synaptik bei erwachsenen Mäusen vor. In diesem Protokoll wird die Cochlea-Lokalisierung bestimmter Frequenzregionen mittels Ortsfrequenzkarten in Verbindung mit Cochleogramm-Daten durchgeführt, woraufhin die morphologischen Eigenschaften von Bandsynapsen mittels synaptischer Immunostaining. Der Funktionelle Status von Bandsynapsen wird dann auf der Grundlage der Amplituden der auditiven Brainstem Response (ABR) Welle I bestimmt. Der vorliegende Bericht zeigt, dass dieser Ansatz genutzt werden kann, um unser Verständnis der Pathogenese und Mechanismen der synaptischen Dysfunktion in der Cochlea zu vertiefen, die bei der Entwicklung neuartiger therapeutischer Interventionen helfen können.
Introduction
Frequenzen im Bereich von ca. 20bis220.000 Hz können vom Menschen als akustische Reize wahrgenommen werden. Das menschliche Gehör ist normalerweise am empfindlichsten in der Nähe von 1.000 Hz, wobei der durchschnittliche Schalldruckpegel bei jungen Erwachsenen bei 20 Pa liegt (d. h. 0 Dezibel Schalldruckpegel [dB SPL]). Unter bestimmten pathologischen Bedingungen ist der Hörverlust auf bestimmte Frequenzen beschränkt. Beispielsweise kann in den frühen Stadien des lärminduzierten Hörverlusts (NIHL) eine “Notch” (d. h. eine Höhe des Hörschwellenwerts) im Audiogramm bei 4 kHz1beobachtet werden. Entlang der Cochlea-Partition des Säugetiers erzeugen ihre Abstufungen von Steifigkeit und Masse eine exponentielle Frequenzkarte mit hochfrequenter Schallerkennung an der Basis der Cochlea und Niederfrequenz-Detektion an der Spitze2. Tatsächlich gibt es entlang der Basilarmembran eine Cochlea-Ortsfrequenzkarte, die zu der so genannten tonotopischen Organisation2,3führt. Jeder angegebene Platz auf der Basilarmembran hat die höchste Empfindlichkeit gegenüber nur einer bestimmten Schallfrequenz, die in der Regel als charakteristische Frequenz3,4bezeichnet wird, obwohl auch Reaktionen auf andere Frequenzen beobachtet werden können.
Bis heute wurden verschiedene Mausmodelle verwendet, um die normale Funktion, pathologische Prozesse und die therapeutische Wirksamkeit im Hörsystem zu untersuchen. Die genaue Kenntnis physiologischer Parameter in der Mauscochlea ist Voraussetzung für solche Studien zum Hörverlust. Die Maus-Cochlea ist anatomisch in apikale, mittlere und basale Drehungen unterteilt, die unterschiedlichen Frequenzbereichen entsprechen. Durch die Kennzeichnung von auditiven Nervenaffeen am Cochlea-Kern zur Analyse der entsprechenden peripheren Innervationsstellen in der Cochlea gelang es Müller et al. die Erstellung der Cochlea-Ortsfrequenzkarte in der normalen Maus in vivo5. Im Intervall von 7,2–61,8 kHz, was Positionen zwischen 90% und 10% der gesamten Länge der Basilarmembran entspricht, kann die Maus-Cochlea-Ortfrequenzkarte durch eine einfache lineare Regressionsfunktion beschrieben werden, was auf eine Beziehung zwischen normalisierter Abstand von der Cochlea-Basis und dem Logarithmus der Charakteristischen Frequenz5. Bei Labormäusen kann die Ortsfrequenzkarte verwendet werden, um den Zusammenhang zwischen Hörschwellen innerhalb bestimmter Frequenzbereiche und Cochleogrammen zu untersuchen, die die Anzahl fehlender Haarzellen in relativen Regionen entlang der Basilarmembran6zeigen. Wichtig ist, dass die Ortsfrequenzkarte ein Positionierungssystem für die Untersuchung minimaler struktureller Schäden bietet, wie z. B. Schäden an den Bandsynapsen von Haarzellen an bestimmten Cochlea-Frequenzorten bei Mäusen mit peripherem Hörtrauma7 ,8.
In der Säugetier-Cochlea bestehen Bandsynapsen aus einem präsynaptischen Band, einer elektronendichten Projektion, die einen Halo von freilos reifen synaptischen Vesikeln, die Glutamat im IHC enthalten, und einer postsynaptischen Dichte am Nerventerminal des SGN mit Glutamatrezeptoren9. Bei der Cochlea-Schalltransduktion führt die Ablenkung des Haarzellbündels zu einer IHC-Depolarisation, die zu einer Glutamatfreisetzung von IHCs auf die postsynaptischen affetischen Klemmen führt und so den Gehörweg aktiviert. Die Aktivierung dieses Weges führt zur Umwandlung schallinduzierter mechanischer Signale in einen Ratencode in der SGN10. Tatsächlich ist die IHC-Bandsynapse hochspezialisiert für unermüdliche Schallübertragung mit Raten von Hunderten von Hertz mit hoher zeitlicher Präzision und ist von entscheidender Bedeutung für präsynaptische Mechanismen der Klangcodierung. Frühere Studien haben gezeigt, dass Bandsynapsen stark in Größe und Anzahl in verschiedenen Frequenzregionen in der erwachsenen Maus Cochlea11,12, wahrscheinlich reflektieren strukturelle Anpassung an die besondere Klangkodierung für Überlebensbedürfnisse. In jüngster Zeit haben experimentelle Tierstudien gezeigt, dass die Cochlea-Synaptopathie zu mehreren Formen von Hörstörungen beiträgt, einschließlich lärmbedingter Hörverluste, altersbedingter Hörverlust und erblichem Hörverlust13, 14. So wurden Methoden zur Identifizierung korrelierter Veränderungen der synaptischen Anzahl, Struktur und Funktion in bestimmten Frequenzregionen zunehmend in Studien zur auditiven Entwicklung und Der Inneren Ohrenkrankheit eingesetzt, indem Modelle verwendet wurden, die über experimentelle Manipulation von genetischen oder Umweltvariablen15,16,17.
Im aktuellen Bericht stellen wir ein Protokoll zur Analyse der synaptischen Anzahl, Struktur und Funktion in einem bestimmten Frequenzbereich der Basilarmembran bei erwachsenen Mäusen vor. Die Cochlea-Frequenzlokalisierung wird mit einer bestimmten Orts-Frequenz-Karte in Kombination mit einem Cochleogramm durchgeführt. Die normalen morphologischen Eigenschaften von Cochlea-Band-Synapsen werden mittels präsynaptischer und postsynaptischer Immunostainierung bewertet. Der Funktionszustand von Cochlea-Band-Synapsen wird anhand der suprathresholdamplituden der ABR-Welle I bestimmt. Bei geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll verwendet werden, um physiologische oder pathologische Bedingungen in anderen Tiermodellen, einschließlich Ratten, Meerschweinchen und Keimen, zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da die Cochlea-Synaptopathie erstmals bei erwachsenen Mäusen mit einer temporären Schwellenverschiebung (TTS) charakterisiert wurde, die durch 8-u201216 kHz Oktavbandrauschen bei 100 dB SPL für 2 h31induziert wurde, haben Forscher die Auswirkungen der Synaptopathie in verschiedenen Säugetiere, einschließlich Affen und Menschen32,33. Neben der Lärmexposition wurden mehrere andere Erkrankungen mit cochlea-Synaptopathie in Verbindung ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81770997, 81771016, 81830030) unterstützt. das gemeinsame Förderprojekt der Beijing Natural Science Foundation und des Beijing Education Committee (KZ201810025040); der Beijing Natural Science Foundation (7174291); und der China Postdoctoral Science Foundation (2016M601067).
Materials
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 | |
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