マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価
Summary
本原稿は、正常マウスにおけるリボンシナプスの形態学的特徴および機能状態を評価するための実験プロトコルについて説明する。本モデルは、騒音誘発および加齢性共生性シナプトパシー制限モデルにも適している。以前のマウス研究の相関結果についても議論する。
Abstract
内毛細胞(IH)は、リボンシナプスを介してスパイラル神経節ニューロン(SNS)に音響信号を伝達します。いくつかの実験的研究は、毛髪細胞シナプスが感音難聴(SNHL)の初期ターゲットである可能性があることを示しています。このような研究は、IHCとSGN間の異常なシナプス伝達をもたらすリボンシナプス数、構造、または機能の変化を指す人工内科的な「シナプトパシー」の概念を提案している。内膜シナプトパシーは不可逆的であるが、聴覚閾値には影響しない。騒音誘発実験モデルでは、特定の周波数領域におけるIHCシナプスへの制限損傷が、シナプトパシーを特異的に引き起こす環境要因と、この内耳を乱す生理的影響を同定するために用いられる。回路。ここでは、成体マウスにおける特定の周波数領域における人工内科形態および機能を解析するためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、特定の周波数領域の人工的な局在化は、コクレオグラムデータと組み合わせて場所周波数マップを使用して行われ、その後、リボンシナプスの形態学的特性がシナプスを介して評価される免疫染色。リボンシナプスの機能状態は、聴覚脳幹応答(ABR)波Iの振幅に基づいて決定される。本報告は、このアプローチが、新しい治療介入の開発に役立つ可能性のある人工内接管機能不全の病因およびメカニズムに対する理解を深めるために使用できることを示している。
Introduction
約20\u201220,000 Hzの範囲の周波数は、人間によって聴覚刺激として知覚することができる。人間の聴覚は通常、1,000 Hz付近で最も敏感であり、若年成人の平均音圧レベルは20μPa(すなわち、音圧レベル[dB SPL]の0デシベル)である。いくつかの病理学的状態では、難聴は特定の周波数に制限されます。例えば、騒音性難聴(NIHL)の初期段階では、「ノッチ」(すなわち、聴力閾値の上昇)を4kHz1のオーディオグラムで観察することができる。哺乳類の人工内来の人工内陸部に沿って、剛性と質量のグラデーションは指数関数的な周波数マップを生成し、高周波音検出を人工内陸部の基部に、頂点2で低周波検出します。確かに、基底膜に沿って内々の場所周波数マップがあり、トノトピック組織2、3として知られているものにつながる。基底膜上の各所定の場所は、通常、特性周波数3、4と呼べられている1つの特定の音周波数に対してのみ最高の感度を有するが、他の周波数に対する応答も観察することができる。
現在までに、聴覚系における正常な機能、病理学的プロセス、および治療効果を調べるには、様々なマウスモデルが用いられてきた。マウスの菌管内の生理学的パラメータの正確な知識は、難聴のこのような研究のための前提条件です。マウスのコクレアは、解剖学的に異なる周波数領域に対応する頂点、中間、基底ターンに分割されます。Müllerらは、内膜核における聴覚神経アフェントを標識して、その対応する末梢内性部位を分析することにより、生体内の通常マウスに内因性の場所周波数マップを確立することに成功した。7.2~61.8kHzの間隔で、バジラー膜の全長の90%から10%の間の位置に相当する、マウスの心状位頻度マップは、単純な線形回帰関数によって記述することができ、との関係を示唆する特徴周波数5の内陸部ベースと対数からの正規化された距離。実験室マウスでは、場所周波数マップを使用して、特定の周波数範囲内の聴覚閾値と、バジラー膜6に沿った相対領域における欠損毛細胞の数を示すコクレオグラムとの関係を調べることができる。重要なことに、場所周波数マップは、末梢聴覚外傷を有するマウスの特定の内気周波数位置における毛髪細胞のリボンシナプスへの損傷など、最小限の構造的損傷を調査するための測位システムを提供する7 、8.
哺乳類の交響合管では、リボンシナプスは、シナプス前のリボン、IHC内のグルタミン酸を含む放出準備のシナプス小胞のハローをつなぎ合う電子密度の突起、およびSGNの神経末端上のポストシナプス密度で構成されています。グルタミン酸受容体9.人工内波音伝達の間、毛細胞束のたわみはIHC脱分極を引き起こし、IHCから後のアフェレント末端へのグルタミン酸放出を引き起こし、それによって聴覚経路を活性化する。この経路の活性化は、SGN10のレートコードに音誘発機械的信号の変換につながります.確かに、IHCリボンシナプスは、高い時間精度で数百ヘルツの速度で不確定な音伝送に非常に特化しており、音符号化の前シナプス機構にとって非常に重要です。これまでの研究では、リボンシナプスは、成人マウスの異なる周波数領域でサイズと数が大きく異なることを明らかにしている11,12,特定のサウンドコーディングに構造的適応を反映する可能性が高い生存の必要性。最近、実験動物実験は、内膜シナプトパシーが、騒音性難聴、加齢性難聴、遺伝性難聴を含む複数の形態の聴覚障害に寄与することを実証している。14.従って、特定の頻度領域におけるシナプス数、構造、および機能の相関変化を同定する方法は、聴覚発達および内耳疾患の研究においてますます採用され、より生成されたモデルを用いて遺伝的または環境変数の実験的操作15,16,17.
本報告では、成体マウスにおける基底膜の特定の周波数領域におけるシナプス数、構造、機能を解析するためのプロトコルを提示する。コクレア周波数局在化は、特定の場所周波数マップを使用して、コクレオグラムと組み合わせて行われます。人工内科の正常な形態学的特徴は、シナプス前および後シナプス免疫染色によって評価される。コクレアリボンシナプスの機能状態は、ABR波Iの超閾値振幅に基づいて決定される。わずかな変更では、このプロトコルは、ラット、モルモット、および細菌を含む他の動物モデルにおける生理学的または病理学的状態を調べるために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
コクレアシナプトパシーは、2時間31の100 dB SPLで8\u201216 kHzオクターブ帯域ノイズによって誘発された一時的閾値シフト(TTS)を有する成体マウスで最初に特徴付けられたので、研究者は、様々なシナプトパシーの効果をますます調査してきました。サルやヒトを含む哺乳類32,33.騒音暴露に加えて、いくつかの他の条件は、他のいくつ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(81770997、81771016、81830030)によって支援されました。北京自然科学財団と北京教育委員会(KZ201810025040)の共同資金プロジェクト。北京自然科学財団(7174291);。中国ポストドクター科学財団(2016M601067)。
Materials
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 | |
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