Avaliação morfológica e funcional de sinapses de fita em regiões de frequência específica da cóclea do rato

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo experimental para avaliar as características morfológicas e o estado funcional das sinapses da fita em camundongos normais. O modelo atual é igualmente apropriado para modelos synaptopathy-restringidos ruído-induzidos e idade-relacionados da coclear. Os resultados correlativos de estudos precedentes do rato são discutidos igualmente.

Abstract

As células ciliadas internas cocleares (IHCs) transmitem sinais acústicos aos neurônios de gânglio espirais (SGNs) através de sinapses de fita. Vários estudos experimentais indicaram que as sinapses das células ciliadas podem ser os alvos iniciais na perda auditiva neurossensorial (SNHL). Tais estudos têm proposto o conceito de “sinaptopatia” coclear, que se refere a alterações no número, estrutura ou função da sinapse da fita que resultam em transmissão sináptica anormal entre IHCs e SGNs. Embora a sinaptopatia coclear seja irreversível, não afeta o limiar auditivo. Em modelos experimentais induzidos por ruído, os danos restritos às sinapses de IHC em regiões de frequência selecionam-se são empregados para identificar os fatores ambientais que causam especificamente o synaptopathy, assim como as conseqüências fisiológicas de perturbar esta orelha interna Circuito. Aqui, apresentamos um protocolo para análise da morfologia sináptica coclear e função em uma região de frequência específica em camundongos adultos. Neste protocolo, a localização coclear de regiões de frequência específica é realizada utilizando-se mapas de frequência de lugar em conjunto com dados de cochleograma, seguindo os quais as características morfológicas das sinapses da fita são avaliadas via sináptica immunostaining. O estado funcional das sinapses da fita é então determinado com base nas amplitudes da onda de resposta auditiva do tronco encefálico (ABR) I. O presente relato demonstra que essa abordagem pode ser utilizada para aprofundar nossa compreensão da patogênese e dos mecanismos de disfunção sináptica na cóclea, o que pode auxiliar no desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas.

Introduction

As freqüências na escala de aproximadamente 20 \ u201220, 000 hertz podem ser percebidas como estímulos auditivos por seres humanos. A audição humana é normalmente mais sensível perto de 1.000 Hz, onde o nível médio de pressão sonora é de 20 μPa em adultos jovens (ou seja, 0 decibéis de nível de pressão sonora [dB SPL]). Em algumas condições patológicas, a perda auditiva é restrita a frequências específicas. Por exemplo, nos estágios iniciais da perda auditiva induzida por ruído (pair), um “entalhe” (i.e., elevação do limiar auditivo) pode ser observado no audiograma a 4 kHz¹. Ao longo da partição coclear de mamíferos, suas gradações de rigidez e massa produzem um mapa de frequência exponencial, com detecção de som de alta frequência na base da cóclea e detecção de baixa frequência no ápice². De fato, há um mapa de localização-frequência coclear ao longo da membrana basilar, levando ao que é conhecido como organização tonotópica^2,3. Cada lugar dado na membrana basilar tem a sensibilidade a mais elevada a somente uma freqüência sadia particular, que seja denominada geralmente a freqüência característica^3,4, embora as respostas a outras freqüências possam igualmente ser observadas.

Até o momento, vários modelos de mouse têm sido empregados para investigar a função normal, processos patológicos e eficácia terapêutica no sistema auditivo. O conhecimento preciso dos parâmetros fisiológicos na cóclea do camundongo é um pré-requisito para esses estudos de perda auditiva. A cóclea do camundongo é dividida anatomicamente em curvas apical, média e basal, que correspondem a diferentes regiões de frequência. Ao rotular os aferentes do nervo auditivo no núcleo coclear para analisar seus locais de inervação periférica correspondentes na cóclea, Müller et al. conseguiram estabelecer o mapa de localização-frequência coclear no rato normal in vivo⁵. No intervalo de 7,2 – 10, 5kHz, o que corresponde a posições entre 90% e a dez% do comprimento total da membrana basilar, o mapa de localização-frequência da cóclea do rato pode ser descrito por uma função de regressão linear simples, sugerindo uma relação entre o distância normalizada da base coclear e o logaritmo da frequência característica⁵. Em camundongos de laboratório, o mapa de frequência local pode ser usado para explorar a relação entre limiares auditivos dentro de faixas de frequência específicas e cocleogramas mostrando o número de células ciliadas ausentes em regiões relativas ao longo da membrana basilar⁶. É importante ressaltar que o mapa de frequência local fornece um sistema de posicionamento para a investigação de danos estruturais mínimos, como danos às sinapses de fita de células ciliadas em locais específicos de frequência coclear em camundongos com trauma auditivo periférico^{7 ,8}.

Na cóclea de mamíferos, as sinapses da fita são compostas de uma fita pré-sináptica, uma projeção elétron-densa que amarras um halo de vesículas sinápticas prontas para liberação contendo glutamato dentro do IHC, e uma densidade pós-sináptica no terminal nervoso do Sgn com receptores de glutamato⁹. Durante a transdução do som coclear, a deflexão do feixe de células ciliadas resulta em despolarização do IHC, o que leva à liberação de glutamato de IHCs para os terminais aferentes pós-sinápticos, ativando assim a via auditiva. A ativação deste caminho conduz à transformação de sinais mecânicos som-induzidos em um código da taxa no SGN¹⁰. Na verdade, a sinapse de fita IHC é altamente especializada para transmissão de som incansável em taxas de centenas de hertz com alta precisão temporal, e é de importância crítica para mecanismos pré-sinápticos de codificação de som. Os estudos precedentes revelaram que as sinapses da fita variam extremamente no tamanho e no número em regiões diferentes da freqüência no rato adulto cóclea^11,12, refletindo provavelmente a adaptação estrutural à codificação sadia particular para necessidades de sobrevivência. Recentemente, estudos experimentais em animais demonstraram que a sinaptopatia coclear contribui para múltiplas formas de deficiências auditivas, incluindo perda auditiva induzida por ruído, perda auditiva relacionada à idade e perda auditiva hereditária^{13, 14}. assim, métodos para identificação de alterações correlatas no número, estrutura e função sináptica em regiões de frequência específica têm sido cada vez mais empregados em estudos de desenvolvimento auditivo e doença da orelha interna, utilizando modelos gerados via manipulação experimental de variáveis genéticas ou ambientais^15,16,17.

No presente relato, apresentamos um protocolo para analisar o número, a estrutura e a função sináptica em uma região de frequência específica da membrana basilar em camundongos adultos. A localização da frequência coclear é realizada utilizando-se um determinado mapa de frequência local em combinação com um cócleograma. As características morfológicas normais das sinapses da fita coclear são avaliadas via imunomarcação pré-sináptica e pós-synaptica. O estado funcional das sinapses da fita coclear é determinado com base nas amplitudes do estímulo da onda I de abr. Com pequenas alterações, este protocolo pode ser usado para examinar as condições fisiológicas ou patológicas em outros modelos animais, incluindo ratos, cobaias e gerbils.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o guia NRC/ILAR para o cuidado e uso de animais de laboratório (8ª edição). O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de medicina de capital, Pequim, China. 1. seleção animal Para todos os experimentos, use camundongos adultos C57BL/6J machos (8 semanas de idade) como modelo animal.Nota: Camundongos C57BL/6J portadores de uma variante de Sp…

Representative Results

Os testes auditivos de ABR foram realizados para camundongos 10 C57BL/6J (8 semanas de idade) anestesia. Os ABRs foram eliciados usando estímulos de burst de Tom em 4, 8, 16, 32 e 48 kHz. O limiar auditivo de cada animal foi detectado visualmente por distinguir pelo menos uma forma de onda clara no PEATE. Todos os camundongos exibiram limiares de PEATE em resposta a rajadas de Tom, variando entre 25 e 70 dB NPS dependendo da frequência do estímulo. Nossos resultados indicaram que o limiar auditivo foi menor em 16 kHz …

Discussion

Desde que o synaptopathy coclear foi caracterizado primeiramente em ratos adultos com um deslocamento provisório do ponto inicial (TTS) induzido pelo ruído da faixa de oitava de 8 \ u201216 kHz em 100 dB SPL para 2 h³¹, os investigadores investigaram cada vez mais os efeitos do synaptopathy em vários mamíferos, incluindo macacos e seres humanos^32,33. Além da exposição ao ruído, várias outras condições têm sido associadas à sin…

Materials

Ketamine hydrochloride	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100mg/kg
Xylazine hydrochloride	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-1251	10mg/kg
TDT physiology apparatus	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	Auditory Physiology System III
Electric Pad	Pet Fun	11072931136
Dumont forceps 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada	0203-3-PO
Dumont forceps 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada	0209-5-PO
Stereo dissection microscope	Nikon Corp., Tokyo, Japan	SMZ1270
Goat serum	ZSGB-BIO, Beijing,China	ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, USA	MAB397	mouse
Purified Mouse Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, USA	612044	mouse
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21124	goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21131	goat
Mounting medium containing DAPI	ZSGB-BIO, Beijing,China	ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	TCS SP8 II
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA	version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China	HS-OT10
Needle electrode	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China	1029	20 mm, 28 G
Closed-field speaker	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	CF1