Summary

Морфологическая и функциональная оценка лентовых синапсов в специфических частотных регионах ущелья мыши

Published: May 10, 2019
doi:

Summary

Данная рукопись описывает экспериментальный протокол для оценки морфологических характеристик и функционального состояния ленточных синапсов у обычных мышей. Нынешняя модель также подходит для моделей, вызванных шумом и возрастной кохлеарной синаптопатией. Обсуждаются также коррелятивные результаты предыдущих исследований мышей.

Abstract

Кохлеарные внутренние волосковые клетки (IHCs) передают акустические сигналы спиральным ганглионным нейронам (SGNs) через ленточные синапсы. Несколько экспериментальных исследований показали, что синапсы волосяных клеток могут быть первоначальными целями в сенсорной потере слуха (SNHL). Такие исследования предложили концепцию кохлеарной “синаптопатии”, которая относится к изменениям в ленте синапсе номер, структура, или функции, которые приводят к аномальной синаптической передачи между IHCs и SGNs. Хотя кохлеарная синаптопатия необратима, она не влияет на порог слуха. В шумопоминированных экспериментальных моделях для выявления факторов окружающей среды, которые конкретно вызывают синаптопатию, а также физиологические последствия нарушения этого внутреннего уха, используется ограниченный ущерб синапсазам IHC Цепи. Здесь мы представляем протокол для анализа кохлеарной синаптической морфологии и функции в определенной частотной области у взрослых мышей. В этом протоколе кохлеарная локализация конкретных частотных регионов осуществляется с использованием точепериодических карт в сочетании с данными кохлеограммы, после чего морфологические характеристики ленточных синапсов оцениваются с помощью синаптических иммунодефицита. Функциональное состояние лентовых синапсов определяется на основе амплитуд слуховой реакции ствола мозга (ABR) волны I. Настоящий доклад показывает, что этот подход может быть использован для углубления нашего понимания патогенеза и механизмов синаптической дисфункции в улинеи, которые могут помочь в разработке новых терапевтических вмешательств.

Introduction

Частоты в диапазоне примерно 20-2020 000 Гц могут быть восприняты людьми как слуховые стимулы. Слух человека, как правило, наиболее чувствителен около 1000 Гц, где средний уровень звукового давления составляет 20 «Па у молодых людей» (т.е. 0 децибел уровня звукового давления (dB SPL). В некоторых патологических условиях потеря слуха ограничивается определенными частотами. Например, на ранних стадиях шумоизоляции слуха (NIHL) в аудиограмме 4 кГц1можно наблюдать «зазубрины» (т.е. высота порога слуха). Вдоль кохлеарной перегородки млекопитающих, его градации жесткости и массы производят экспоненциальную частотную карту, с высокочастотным обнаружением звука у основания улитки и низкочастотным обнаружением на вершине2. Действительно, есть кохлеарные места-частоты карты вдоль базилярной мембраны, что приводит к тому, что известно как тонотопическая организация2,3. Каждое данное место на базилярной мембране имеет самую высокую чувствительностьтолько к одной конкретной частоте звука, которая обычно называется характерной частотой 3,4,хотя ответы на другие частоты также можно наблюдать.

На сегодняшний день, различные модели мыши были использованы для исследования нормальной функции, патологических процессов и терапевтической эффективности в слуховой системе. Точное знание физиологических параметров в улине мыши является необходимым условием для таких исследований потери слуха. Улишамышь мыши анатомически разделена на апикальные, средние и базальные повороты, которые соответствуют различным частотным регионам. Путем маркировки слуховых нервных афферентов в кохлеарном ядре для анализа их соответствующих периферических иннервационных участков в улитке, Мюллер и др. удалось создать кохлеарную карту места-частоты в нормальной мыши in vivo5. В интервале 7,2-61,8 кГц, что соответствует позициям между 90% и 10% от полной длины базилярной мембраны, кохлеарная карта места мыши может быть описана простой линейной регрессионной функцией, предполагая связь между нормализованное расстояние от кохлеарного основания и logarithm характерной частоты5. В лабораторных мышей, место-частота карта может быть использована для изучения взаимосвязи между порогами слуха в пределах определенных диапазонов частот и cochleograms показаны номера отсутствующих волосковых клеток в относительных регионах вдоль базилярной мембраны6. Важно отметить, что карта частоты места обеспечивает систему позиционирования для исследования минимальных структурных повреждений, таких как повреждение ленточных синапсов волосковых клеток в определенных кохлеарных частотных местах у мышей с периферической слуховой травмой7 ,8.

В улитке млекопитающих, лента синапсы состоят из пресинаптической ленты, электронно-плотная проекция, которая привязывает ореол готовых к выпуску синаптические пузырьки, содержащие глутамат в IHC, и постсинаптическая плотность на нервном терминале SGN с рецепторами глутамата9. Во время кохлеарного звука трансдукции, отклонение расслоения волосяных клеток приводит к деполяризации IHC, что приводит к освобождению глутамата от IHCs на постсинаптических афферентных терминалов, тем самым активируя слуховой путь. Активация этого пути приводит к преобразованию звуковых механических сигналов в тарифный код в SGN10. Действительно, синапс ленты IHC специализируется на неутомимой передаче звука со скоростью сотен Герц с высокой временной точностью, и имеет решающее значение для пресинапических механизмов кодирования звука. Предыдущие исследования показали, что лента синапсы сильно различаются по размеру и количеству в различных регионах частоты в взрослой улитке мыши11,12, вероятно, отражает структурную адаптацию к конкретной звукового кодирования для потребности в выживании. Недавно экспериментальные исследования на животных показали, что кохлеарная синаптопатия способствует множественным формам нарушений слуха, включая шумоизоляцию слуха, возрастную потерю слуха и наследственное снижение слуха13, 14. Таким образом, методы выявления коррелированных изменений в синаптическом числе, структуре и функции в конкретных частотных регионах все чаще используются в исследованиях слухового развития и заболеваний внутреннего уха, используя модели, генерируемые с помощью экспериментальные манипуляции генетическими или экологическими переменными15,16,17.

В текущем отчете мы представляем протокол для анализа синаптического числа, структуры и функции в определенной частотной области базилярной мембраны у взрослых мышей. Локализация кохлеарной частоты осуществляется с использованием данной карты частоты места в сочетании с кохлеограммой. Нормальные морфологические характеристики синапсов кохлеарных лент оцениваются с помощью пресинаптического и постсинаптической иммуностоинга. Функциональное состояние синапсов кохлеарных лент определяется на основе надпороговых амплитуд волны I. При незначительных изменениях, этот протокол может быть использован для изучения физиологических или патологических условий в других животных моделей, в том числе крыс, морских свинок, и песчанки.

Protocol

Все процедуры проводились в соответствии с Руководством NRC/ILAR по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание). Протокол исследования был одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Столичного медицинского университета, Пекин, Китай. <p class="jove_title…

Representative Results

ABR слуховые тесты были проведены для 10 C57BL/6J мышей (8 недель возраста) под наркозом. ABRs были вызваны с использованием тон взрыв стимулы на 4, 8, 16, 32, и 48 кГц. Порог слуха каждого животного был визуально обнаружен, различая по крайней мере одну четкую форму волны в АБР. Все мыши выставлены ABR пор…

Discussion

Так как кохлеарная синаптопатия была впервые охарактеризована у взрослых мышей с временным сдвигом порога (TTS), индуцированным 8’u201216 кГц октавный шум полосы на 100 дБ SPL для 2 ч31, исследователи все чаще исследовали последствия синаптопатии в различных млекопитающих, в том чис?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81770997, 81771016, 81830030); совместный проект финансирования Пекинского фонда естественных наук и Пекинского комитета по образованию (K’201810025040); Пекинский фонд естественных наук (7174291); и Китайский фонд постдокторской науки (2016M601067).

Materials

Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1

References

  1. Lie, A., Skogstad, M., Johnsen, T. S., Engdahl, B., Tambs, K. The prevalence of notched audiograms in a cross-sectional study of 12,055 railway workers. Ear and Hearing. 36 (3), 86-92 (2015).
  2. Fettiplace, R. Hair cell transduction, tuning, and synaptic transmission in the mammalian cochlea. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1197-1227 (2017).
  3. Liberman, M. C. The cochlear frequency map for the cat: labeling auditory-nerve fibers of known characteristic frequency. Journal of the Acoustical Society of America. 72 (5), 1441-1449 (1982).
  4. Fettiplace, R., Kim, K. X. The physiology of mechanoelectrical transduction channels in hearing. Physiological Reviews. 94 (3), 951-986 (2014).
  5. Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
  6. Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-2), 1-10 (2004).
  7. Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6, 25056 (2016).
  8. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in “recovered” ears. Journal of Neuroscience. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  9. Wichmann, C., Moser, T. Relating structure and function of inner hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 361 (1), 95-114 (2015).
  10. Matthews, G., Fuchs, P. The diverse roles of ribbon synapses in sensory neurotransmission. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 812-822 (2010).
  11. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Postnatal maturation of auditory-nerve heterogeneity, as seen in spatial gradients of synapse morphology in the inner hair cell area. Hearing Research. 339, 12-22 (2016).
  12. Yang, L., et al. Maximal number of pre-synaptic ribbons are formed in cochlear region corresponding to middle frequency in mice. Acta Oto-Laryngologica. 138 (1), 25-30 (2018).
  13. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hearing Research. 349, 138-147 (2017).
  14. Moser, T., Starr, A. Auditory neuropathy–neural and synaptic mechanisms. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 135-149 (2016).
  15. Yu, W. M., et al. A Gata3-Mafb transcriptional network directs post-synaptic differentiation in synapses specialized for hearing. Elife. 2, 01341 (2013).
  16. Buniello, A., et al. Wbp2 is required for normal glutamatergic synapses in the cochlea and is crucial for hearing. EMBO Molecular Medicine. 8 (3), 191-207 (2016).
  17. Gilels, F., Paquette, S. T., Beaulac, H. J., Bullen, A., White, P. M. Severe hearing loss and outer hair cell death in homozygous Foxo3 knockout mice after moderate noise exposure. Scientific Reports. 7 (1), 1054 (2017).
  18. Kane, K. L., et al. Genetic background effects on age-related hearing loss associated with Cdh23 variants in mice. Hearing Research. 283 (1-2), 80-88 (2012).
  19. Jiang, X. W., Li, X. R., Zhang, Y. P. Changes of ribbon synapses number of cochlear hair cells in C57BL/6J mice with age (Delta). International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (10), 19058-19064 (2015).
  20. Akil, O., Oursler, A., Fan, K., Lustig, L. Mouse auditory brainstem response testing. BIO-Protocol. 6 (6), (2016).
  21. Zhou, X., Jen, P. H. -. S., Seburn, K. L., Frankel, W. N., Zheng, Q. Y. Auditory brainstem responses in 10 inbred strains of mice. Brain Research. 1091 (1), 16-26 (2006).
  22. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
  23. Schmitz, F., Konigstorfer, A., Sudhof, T. C. RIBEYE, a component of synaptic ribbons: a protein’s journey through evolution provides insight into synaptic ribbon function. Neuron. 28 (3), 857-872 (2000).
  24. Suzuki, J., Corfas, G., Liberman, M. C. Round-window delivery of neurotrophin 3 regenerates cochlear synapses after acoustic overexposure. Scientific Reports. 6, 24907 (2016).
  25. Rutherford, M. A. Resolving the structure of inner ear ribbon synapses with STED microscopy. Synapse. 69 (5), 242-255 (2015).
  26. Liberman, L. D., Liberman, M. C. Dynamics of cochlear synaptopathy after acoustic overexposure. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 16 (2), 205-219 (2015).
  27. Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
  28. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
  29. Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: an early-onset contributor to auditory functional decline. Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
  30. Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
  31. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  32. Valero, M. D., et al. Noise-induced cochlear synaptopathy in rhesus monkeys (Macaca mulatta). Hearing Research. 353, 213-223 (2017).
  33. Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
  34. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 14 (3), 321-329 (2013).
  35. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
  36. Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. Effects of Aging and Noise Exposure on Auditory Brainstem Responses and Number of Presynaptic Ribbons in Inner Hair Cells of C57BL/6J Mice. Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).
  37. Mehraei, G., et al. Auditory brainstem response latency in noise as a marker of cochlear synaptopathy. Journal of Neuroscience. 36 (13), 3755-3764 (2016).

Play Video

Cite This Article
Yu, S., Du, Z., Song, Q., Qu, T., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).

View Video