Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones
Summary
Este manuscrito describe un protocolo experimental para evaluar las características morfológicas y el estado funcional de las sinapsis de cinta en ratones normales. El modelo actual también es adecuado para modelos de sinaptopatía coclear inducidas por ruido y relacionados con la edad. También se discuten los resultados correlativos de estudios anteriores del ratón.
Abstract
Las células del vello interno coclear (ICH) transmiten señales acústicas a las neuronas ganglionares espirales (SGN) a través de las sinapsis de cinta. Varios estudios experimentales han indicado que las sinapsis de células pilosas pueden ser los objetivos iniciales de la hipoacusia neurosensorial (SNHL). Tales estudios han propuesto el concepto de “sinaptoopatía” coclear, que se refiere a alteraciones en el número, estructura o función de la siinas de cinta que dan lugar a una transmisión sináptica anormal entre los IHC y los SCN. Si bien la sinaptoopatía coclear es irreversible, no afecta al umbral auditivo. En los modelos experimentales inducidos por ruido, se emplean daños restringidos a las sinapsis de IHC en regiones de frecuencia selectas para identificar los factores ambientales que causan específicamente la sinaptopatía, así como las consecuencias fisiológicas de perturbar este oído interno Circuito. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la morfología sináptica coclear y la función en una región de frecuencia específica en ratones adultos. En este protocolo, la localización coclear de regiones de frecuencia específicas se realiza utilizando mapas de frecuencia de lugar junto con datos de coclearografía, tras los cuales las características morfológicas de las sinapsis de cinta se evalúan a través de sinápticas Immunostaining. El estado funcional de las sinapsis de cinta se determina entonces en función de las amplitudes de la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) onda I. El presente informe demuestra que este enfoque puede utilizarse para profundizar nuestra comprensión de la patogénesis y los mecanismos de la disfunción sináptica en la cócleara, lo que puede ayudar en el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.
Introduction
Las frecuencias en el rango de aproximadamente 20 u201220,000 Hz pueden ser percibidas como estímulos auditivos por los seres humanos. La audición humana es normalmente más sensible cerca de 1.000 Hz, donde el nivel medio de presión sonora es de 20 oP en adultos jóvenes (es decir, 0 decibelios de nivel de presión sonora [dB SPL]). En algunas condiciones patológicas, la pérdida auditiva está restringida a frecuencias específicas. Por ejemplo, en las primeras etapas de la pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL), se puede observar una “notch” (es decir, elevación del umbral auditivo) en el audiograma a 4 kHz1. A lo largo de la partición coclear de mamíferos, sus gradaciones de rigidez y masa producen un mapa de frecuencia exponencial,con detección de sonido de alta frecuencia en la base de la cócleara y detección de baja frecuencia en el ápice 2. De hecho, hay un mapa de frecuencia de lugar coclear a lo largo de la membrana basilar, que conduce a lo que se conoce como organización tonotópica2,3. Cada lugar dado en la membrana basilar tiene la sensibilidad más alta a una sola frecuencia de sonido particular, que generalmente se denomina la frecuencia característica3,4, aunque también se pueden observar respuestas a otras frecuencias.
Hasta la fecha, se han empleado varios modelos de ratón para investigar la función normal, los procesos patológicos y la eficacia terapéutica en el sistema auditivo. El conocimiento preciso de los parámetros fisiológicos en la cócleara del ratón es un requisito previo para estos estudios de pérdida auditiva. La cócleara de ratón se divide anatómicamente en giros apicales, medios y basales, que corresponden a diferentes regiones de frecuencia. Mediante el etiquetado de los afferents de nervio auditivo en el núcleo coclear para analizar sus correspondientes sitios de inervación periférica en la cócleara, m’ller et al. lograron establecer el mapa de frecuencia de lugar coclear en el ratón normal in vivo5. En el intervalo de 7,2–61,8 kHz, que corresponde a posiciones entre el 90% y el 10% de la longitud total de la membrana basilar, el mapa de frecuencia de lugar coclear del ratón se puede describir mediante una simple función de regresión lineal, lo que sugiere una relación entre el distancia normalizada desde la base coclear y el ritmoritmo de la frecuencia característica5. En ratones de laboratorio, el mapa de frecuencia de lugar se puede utilizar para explorar la relación entre los umbrales auditivosdentro de rangos de frecuencia específicos y los cocleares que muestran el número de células pilosas que faltan en regiones relativas a lo largo de la membrana basilar 6. Es importante destacar que el mapa de frecuencia de lugar proporciona un sistema de posicionamiento para la investigación de daños estructurales mínimos, como daños en las sinapsis de la cinta de las células pilosas en lugares específicos de frecuencia coclear en ratones con trauma auditivo periférico7 ,8.
En la cóclea de mamíferos, las sinapsis de cinta se componen de una cinta presináptica, una proyección de electrones denso que ate un halo de vesículas sinápticas listas para liberación que contengan glutamato dentro del IHC, y una densidad postsináptica en el terminal nervioso de la SGN con receptores de glutamato9. Durante la transducción del sonido coclear, la desviación del haz de células pilosas resulta en la despolarización de IHC, que conduce a la liberación de glutamato de los IHC en los terminales aferentes postsinápticos, activando así la vía auditiva. La activación de esta vía conduce a la transformación de señales mecánicas inducidas por el sonido en un código de velocidad en el SGN10. De hecho, la sinapsis de cinta IHC está altamente especializada para la transmisión de sonido infatigable a velocidades de cientos de hercios con alta precisión temporal, y es de importancia crítica para los mecanismos presinápticos de codificación de sonido. Estudios anteriores han revelado que las sinapsis de cinta varían mucho en tamaño y número en diferentes regiones de frecuencia en la cócleara de ratón adulta11,12, probablemente reflejando la adaptación estructural a la codificación de sonido particular para necesidades de supervivencia. Recientemente, estudios experimentales en animales han demostrado que la sinaptopatía coclear contribuye a múltiples formas de deficiencias auditivas, incluyendo pérdida auditiva inducida por ruido, pérdida auditiva relacionada con la edad y pérdida auditiva hereditaria13, 14. Así, los métodos para identificar los cambios correlacionados en el número, la estructura y la función sinápticas en regiones de frecuencia específicas se han empleado cada vez más en estudios de desarrollo auditivo y enfermedad del oído interno, utilizando modelos generados a través de manipulación experimental de variables genéticas o ambientales15,16,17.
En el informe actual, presentamos un protocolo para analizar el número sináptico, la estructura y la función en una región de frecuencia específica de la membrana basilar en ratones adultos. La localización de frecuencia coclear se realiza utilizando un mapa de frecuencia de lugar determinado en combinación con un coclearografía. Las características morfológicas normales de las sinapsis de cinta coclear se evalúan mediante inmunomanchas presinápticas y postsinápticas. El estado funcional de las sinapsis de la cinta coclear se determina en función de las amplitudes supraumbral de la onda ABR I. Con alteraciones menores, este protocolo se puede utilizar para examinar condiciones fisiológicas o patológicas en otros modelos animales, incluyendo ratas, conejillos de indias y jerbos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dado que la sinaptoopatía coclear se caracterizó por primera vez en ratones adultos con un desplazamiento temporal de umbral (TTS) inducido por el ruido de banda de octava de 8 u201216 kHz a 100 dB SPL durante 2 h31, los investigadores han investigado cada vez más los efectos de la sinaptopatía en varios mamíferos, incluyendo monos y humanos32,33. Además de la exposición al ruido, varias otras condiciones se han asociado con la sina…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81770997, 81771016, 81830030); el proyecto de financiación conjunta de beijing Natural Science Foundation y Beijing Education Committee (KZ201810025040); la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7174291); y la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (2016M601067).
Materials
| Ketamine hydrochloride | Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China | H35020148 | 100mg/kg |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | X-1251 | 10mg/kg |
| TDT physiology apparatus | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| SigGen/BioSig software | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | Auditory Physiology System III | |
| Electric Pad | Pet Fun | 11072931136 | |
| Dumont forceps 3# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0203-3-PO | |
| Dumont forceps 5# | Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada | 0209-5-PO | |
| Stereo dissection microscope | Nikon Corp., Tokyo, Japan | SMZ1270 | |
| Goat serum | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9021 | |
| Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 | Millipore Corp., Billerica, MA, USA | MAB397 | mouse |
| Purified Mouse Anti-CtBP2 | BD Biosciences, Billerica, MA, USA | 612044 | mouse |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21124 | goat |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA | A21131 | goat |
| Mounting medium containing DAPI | ZSGB-BIO, Beijing,China | ZLI-9557 | |
| Confocal fluorescent microscopy | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS SP8 II | |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Professional diagnostic pocket otoscope | Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China | HS-OT10 | |
| Needle electrode | Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China | 1029 | 20 mm, 28 G |
| Closed-field speaker | Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA | CF1 | |
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