הקרנת מבחני עבור הערכה של השפעות על Ca2 +תפוקה בינונית-איתות ותגובה Acrosome זרע אנושי

Summary

הנה, שני מבחני תפוקה בינונית עבור הערכה של השפעות על Ca^{2 +}-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי מתוארים. מבחני אלה יכולים לשמש בקלות ובמהירות מסך כמויות גדולות של תרכובות עבור אפקטים על Ca^{2 +}-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי.

Abstract

Ca^{2 +}-איתות חיונית כדי תפקוד נורמלי תא הזרע ואת פוריות הגבר. באופן דומה, התגובה acrosome חיוני על היכולת של תא זרע אנושי כדי לחדור את pellucida zona להפרות את הביצית. לכן זה עניין רב לבדיקת תרכובות (למשל, כימיקלים סביבתיים או מועמדים סמים) על השפעתם על Ca^{2 +}-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי גם לבחון את ההשפעות השליליות פוטנציאליים על תפקוד תאי זרע אדם או לחקור תפקיד אפשרי כמו מניעה. כאן, מתוארים שני מבחני תפוקה בינונית: 1) מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay עבור הערכה של השפעות על Ca^{2 +}-איתות זרע אנושי, ואת וזמינותו cytometric 2) על התמונה להערכה של תגובה acrosome זרע אנושי. מבחני אלה יכולים לשמש מסך מספר רב של תרכובות עבור אפקטים על Ca^{2 +}-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי. יתר על כן, מבחני ניתן להשתמש כדי ליצור עקומות מנה-תגובה מאוד ספציפי של תרכובות בודדים, לקבוע additivity/הסינרגטיות פוטנציאליים עבור תרכובות שניים או יותר, וכדי ללמוד את מצב תרופתי של פעולה באמצעות עיכוב תחרותי ניסויים עם מעכבי CatSper.

Introduction

מטרת מבחני שני המתוארים כאן היא לבחון את ההשפעות על Ca^{2 +}-התגובה באיתות, acrosome זרע אנושי, כפי שהוצגה עבור מספר תרכובות מספר פרסומים העסקת אלו מבחני^{1,2, 3,4,5,6,7}. Ca^{2 +}-איתות התגובה acrosome הם פונקציה חיונית לחיי שגרה תא הזרע האנושי והן פוריות הגבר.

המטרה הכוללת של תא זרע אנושי הוא כדי להפרות את הביצית. כדי להיות מסוגל בהצלחה וישר להפרות את הביצית, הפונקציות של תא הזרע חייב להיות מוסדר בחוזקה במהלך המסע של תא הזרע דרך באיברי הרבייה הנקביים^8,9. מהפונקציות תא הזרע מוסדרים באמצעות תאיים Ca^{2 +}-ריכוז [Ca^{2 +}]_אני (למשל, זרע תנועתיות כימוטקסיס, acrosome התגובה)¹⁰. כמו כן, תהליך התבגרות שנקרא capacitation, אשר הופך את תא הזרע מסוגלים להפרות את הביצית, הוא מוסדר באופן חלקי על ידי [Ca^{2 +}]_אני¹⁰. Ca^{2 +}-הבלטת ממד Ca^{2 +}-ATPase משאבות¹¹ לשמור על קיפול כ 20.000 Ca^{2 +}-מעבר צבע על פני קרום תאי זרע אדם, עם מנוחה [Ca^{2 +}]_אני של 50-100 ננומטר. אם Ca^{2 +} מותר לעבור את קרום התא (למשל, דרך הפתח של Ca^{2 +}-ערוצי), זרם גדולה למדי של Ca^{2 +} מתרחשת, והוליד העלאת [Ca^{2 +}]_אני. עם זאת, גם נושאת תא הזרע Ca תאיים^{2 +}-חנויות, אשר יכול לשחרר Ca^{2 +} ו, לכן, גם לתת לעלות העלאת [Ca^{2 +}]_אני¹². מעניין, כל ערוץ בתיווך Ca^{2 +}-זרם בתאי זרע אדם כה נמצאה להתרחש באמצעות CatSper (חתוליוניים ערוץ של Sperm), אשר מתבטאת רק תאי זרע¹¹. בתאי זרע אנושי, CatSper מופעל על ידי ליגנדים אנדוגני פרוגסטרון פרוסטגלנדינים דרך ליגנד ברורים, מחייב אתרי^13,14,15, שמוביל מהיר Ca^{2 +}-זרם לתוך תא הזרע. שני מקורות עיקריים ליד הביצה מספקים רמות גבוהות של אלה ליגנדים אנדוגני. אחד הוא נוזל הזקיקים מכיל רמות גבוהות של פרוגסטרון¹⁶. הנוזל הזקיקים הוא שוחרר מן בוגרת זקיקים יחד עם הביצה-ביוץ, mixes עם הנוזל בתוך ה-oviducts¹⁷. המקור העיקרי הוא תלולית התאים המקיפים את הביצית ולשחרר רמות גבוהות של פרוגסטרון פרוסטגלנדינים. הפרוגסטרון-induced Ca^{2 +}-זרם בתוך תאי הזרע הוכח לתווך כימוטקסיס לקראת^9,ביצה¹⁸, לשלוט^19,תנועתיות הזרע²⁰ ולעורר את acrosome תגובה²¹. מפעילה של אלה בודדים [Ca^{2 +}]_אני-פונקציות זרע מוסדר בסדר הנכון, בזמן הנכון הוא קריטי עבור הפריה של ביצה⁸. בקו זה, שיוצרת פרוגסטרון-induced Ca^{2 +}-זרם נמצאה שיש לשייך מופחתת פוריות הגבר^{22,23,24,25,26 ,27,28,29} ו CatSper תפקודית הוא חיוני עבור פוריות הגבר^{26,30,31,32, 33,34,35,36}.

כמו תאי הזרע להגיע הביצה, רצף אירועים חייב להתבצע לדישון להתרחש: 1) תאי הזרע חייב לחדור את שכבת תאים cumulus שמסביב, 2) לאגד zona pellucida, 3) exocytose את התוכן acrosomal, התגובה acrosome כביכול ³⁷, 4) לחדור את zona pellucida, ו- 5) מיזוג עם קרום ביצה כדי להשלים דישון³⁸. כדי להיות מסוגל לעבור את השלבים, להפרות את הביצית, תא זרע קודם לעבור capacitation¹¹, שמתחיל כמו תאי הזרע לעזוב את נוזל הזרע המכיל גורמים “decapacitating”³⁹ לשחות לתוך הנוזלים של הנקבה באיברי הרבייה עם רמות גבוהות של ביקרבונט, אלבומין³⁷. Capacitation מעבד את תאי הזרע יכול לעבור hyperactivation, צורה של תנועתיות עם מכות נמרצת של שוטון, וכן acrosome תגובה³⁷. תנועתיות Hyperactivated נדרש עבור חדירה של⁴⁰zona pellucida, acrosome מכיל אנזימים hydrolytic שונים לסייע בתהליך זה חדירה⁴¹. בנוסף, התגובה acrosome מעבד את תאי הזרע מסוגלים פיוזינג עם הביצה על ידי חשיפת חלבונים ספציפיים קרום על פני הזרע הכרחי עבור זרע-ביצה פיוז’ן⁴². כתוצאה מכך, יכולת לעבור התגובה hyperactivation ו- acrosome הם שניהם נדרש להפריה מוצלחת של ביצה^40,42. בניגוד מה כבר ראיתי עבור העכבר תאי זרע^43,44,45, תאי זרע אנושי רק כי הם acrosome-שלם ניתן לאגד zona pellucida⁴⁶. כאשר תאי הזרע האנושי מאוגדים את pellucida zona להם לעבור את התגובה acrosome לחדור zona pellucida⁴¹ והן לחשוף חלבונים ספציפיים ממברנה הנדרשים עבור המיזוג עם ביצה³⁸. העיתוי של התגובה acrosome זרע אנושי ולכן קריטי להפריה להתרחש.

כמתואר לעיל, Ca^{2 +}-מערכת אזעקה היא חיונית עבור זרע נורמלי תא פונקציה⁸, זה, לכן, עניין רב כדי שניתן יהיה מסך מספר רב של תרכובות עבור אפקטים על Ca^{2 +}-איתות בתאי זרע אדם. באופן דומה, ככל האנושי היחיד תאי הזרע עוברים acrosome התגובה בבית המקום והזמן הנכון יכול לחדור את pellucida zona לדשן את הביצה^46,47, זה גם עניין רב כדי שניתן יהיה לבדוק את תרכובות ביכולתם להשפיע על התגובה acrosome זרע אנושי. לשם כך, מתוארים שני תפוקה בינונית מבחני המיון: 1) assay עבור אפקטים על Ca^{2 +}-איתות תאי זרע אנושי, ואת וזמינותו 2) על היכולת לגרום תגובה acrosome תאי זרע אנושי.

Assay 1 הוא בינוני-תפוקה Ca^{2 +}-איתות וזמינותו. טכניקה המבוססת על הקורא צלחת זו קרינה פלואורסצנטית עוקב אחר שינויים בזריחה כפונקציה של הזמן בו זמנית בבארות מרובים. Ca^{2 +}-רגיש הפלורסנט, Fluo-4 יש_ד K עבור Ca^{2 +}≈ 335 ננומטר הוא תא-permeant בדמות אסתר AM (acetoxymethyl). באמצעות Fluo-4, זה אפשרי למדוד שינויים [Ca^{2 +}]_i לאורך זמן, לאחר התוספת של תרכובות לעניין תאי הזרע. וזמינותו פותחה על ידי המעבדה של טימו Strünker 2011¹³ , מאז שימש במספר מחקרים כדי תרכובות מסך עבור אפקטים על Ca^{2 +}-איתות זרע אנושי^{1,2,3, 4,5}. גם שיטה דומה שימש למסך סמים מספר מועמדים⁴⁸. בנוסף, וזמינותו זו היא שימושית גם עבור הערכת מצב תרופתי של פעולה^1,2,3,4,5, עקומות מנה-תגובה^{1, 2,3,4,5}, עיכוב תחרותי^1,2, additivity^1,2והסינרגטיות³ של תרכובות של עניין.

Assay 2 הוא assay התגובה תפוקה בינונית acrosome. טכניקה זו מבוססת על cytometer התמונה מודדת את הכמות של קיימא acrosome הגיב תאי זרע מדגם, באמצעות שלושה צבעי פלורסנט: propidium יודיד (PI), מצמידים FITC לקטין של אפון השדה (FITC-PSA) ולאחר Hoechst-33342. וזמינותו היה שונה מכל שיטה דומה מבוססי cytometry זרימה על-ידי Zoppino et al.⁴⁹ , שימש ב מחקרים מספר^6,7. באשר Ca^{2 +}-איתות assay, assay התגובה acrosome הזה יכול לשמש גם כדי להעריך עקומות מנה-תגובה, עיכוב, additivity והסינרגטיות של תרכובות של עניין.

Protocol

איסוף וניתוח של דגימות זרע אנושי של הפרוטוקולים עוקב אחר הקווים המנחים של ועדת האתיקה במחקר של אזור הבירה של דנמרק. כל דגימות זרע הושגו אחרי מדעת מתורמים מתנדבים. לאחר הלידה, הדגימות היו מלא תשוחררנה. על הנוחות שלהם כל תורם קיבל תשלום של 500 DKK (בערך $75 דולר ארה ב) עבור כל דגימה. הדגימות היו נות?…

Representative Results

נציג תוצאות ניסוי בדיקת ההשפעה של תרכובות 4 (A, B, C ו- D) יחד עם חיובי (פרוגסטרון) ושליטה שלילי (מאגר) על [Ca2 +]i זרע אנושי באמצעות של תפוקה בינונית Ca2 +-איתות assay ניתן לראות באיור 4a. ב- איור 4b, עקומת תגובת המינון של פרוגסטרון מוצג, אש…

Discussion

התפוקה בינוני Ca^{2 +} איתות assay מבוסס על מדידות של זריחה של יחיד microwells המכיל תאי זרע וכ-250,000. האות שנתפסו בממוצע של כל תאי זרע בודדים בתוך הבאר. וזמינותו ובכך מספק שמידע מרחבי לגבי איפה בפרט תא הזרע [Ca^{2 +}]_אני משתנה, כמה גדול שיעור של תאי הזרע בשינוי [Ca^{2 +}]_אני לוקח מקום או …

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer