Ca2 +の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応

Summary

ここでは、Ca^{2 +}の効果の評価のための 2 つの媒体スループット アッセイ-ひと精子シグナリングと先体反応を示します。これらのアッセイは、迅速かつ容易に大量の Ca^{2 +}に対する効果のための化合物をスクリーニングするため使用ことができます-ひと精子シグナリングと先体反応。

Abstract

Ca^{2 +}-信号が正常な精子細胞機能と男性の生殖能力に不可欠であります。同様に、先体反応は、透明帯を貫通し、卵子を受精させる精子細胞の機能に不可欠です。ですので、テスト混合物 (例えば、環境化学物質、薬剤の候補者) の Ca^{2 +}の影響についての関心-ひと精子シグナリングと先体反応ひと精子細胞の機能の潜在的有害作用を調べるかまたは避妊薬としての可能な役割を調査。2 つの媒体スループット アッセイの説明ここでは、: 1) 蛍光を用いた Ca^{2 +}への影響評価の測定-ヒトの精子と 2) ひと精子先体反応の評価イメージ フローサイトメトリーによるアッセイのシグナルします。これらのアッセイは、多数の Ca^{2 +}に対する効果のための化合物をスクリーニングするため使用ことができます-ひと精子シグナリングと先体反応。個々 の化合物の非常に特定の用量-反応曲線を生成する 2 つ以上の化合物の潜在的な加法性/相乗効果を決定し、競争の抑制を介してアクションの薬理学的特性を研究する、アッセイを使用ことができますさらに、医学: CatSper 阻害剤で実験。

Introduction

ここで説明した 2 つの試金の目的は Ca^{2 +}の効果を検討する-シグナル伝達と先体反応ひと精子での示されている、これらを用いたいくつかの出版物の複数の化合物の試金の^{1,2、 3,4,5,6,7}。Ca^{2 +}-シグナル伝達と精子先体反応が正常に重要なひと精子細胞の機能と男性の生殖能力。

ヒトの精子細胞の全体的な目標は、卵を受精することです。正常にし、自然卵を受精させることができるには、精子細胞の機能は、女性の生殖器官の^8,9を介して精子細胞の旅の間にしっかりと調整されなければなりません。精子細胞機能の多くが規制されるを介して細胞内 Ca^{2 +}の濃度 [Ca^{2 +}]_私(例えば、精子性、走化性、並びにアクロゾーム反応)¹⁰。また、精子細胞は卵を肥やすことが可能なレンダリング、精子受精能獲得と呼ばれる成熟プロセスは [Ca^{2 +}] によって部分的に規制の_私¹⁰です。Ca^{2 +}-押し出し Ca^{2 +}-ATPase ポンプ¹¹を維持、およそ 20.000 折り Ca^{2 +}-、休憩 [Ca^{2 +}]_私50 ~ 100 nM のと、人間の精子細胞膜上のグラデーション。Ca^{2 +}ができるか細胞膜を通過 (例えば、Ca^{2 +}の開口部を通って-チャンネル)、[Ca^{2 +}]_私の昇格に上昇を与える Ca^{2 +}のかなりの流入が発生します。しかし、また精子細胞を運ぶ細胞内 Ca^{2 +}-ストアは、Ca^{2 +}を解放できると、したがって、また与える上昇 [Ca^{2 +}]_私¹²の昇格。興味深いことに、すべてチャネルを介する Ca^{2 +}-人間の精子細胞の流入が精子細胞¹¹でしか表現が医学: CatSper (猫 Sperm のイオン チャネル)、を介して発生する見つかったところ。ヒトの精子細胞医学: CatSper をアクティブに内因性リガンド プロゲステロンと異なるリガンドでサイト^13,14,15を介してプロスタグランジンによる急速な Ca^{2 +}の流入精子細胞。卵の近くの 2 つの主な情報源は、これらの内因性リガンドの高レベルを提供します。プロゲステロン¹⁶の高レベルを含む卵胞液であります。一緒に排卵、卵管¹⁷内流体と混合で卵成熟卵胞から卵胞液を発売します。その他の主なソースは卵丘細胞卵を囲む、高レベルのプロゲステロンとプロスタグランジンの解放です。プロゲステロン誘発性 Ca^{2 +}-精子細胞の流入が卵^9,18に向かって走化性を仲介する、精子運動^19,20を制御し、精子を刺激するために示されています。反応²¹。これら個々 [Ca^{2 +}]_私のトリガー-⁸卵の受精の正しい時刻に正しい順序で調整した精子機能は欠かせません。これに伴い、最適なプロゲステロン誘発性 Ca^{2 +}の流入は男性不妊治療^{22,23,24,25,26 を削減することができる発見されています。 ,27,28,29} ・機能医学: CatSper が男性の生殖能力^{26,30,31,32、不可欠 33,34,35,36}。

精子細胞卵に到達と一連のイベントが発生する受精のための場所を取る必要があります: 1)、精子細胞必要が周囲の卵丘細胞層に浸透、2) 透明帯にバインド、3) exocytose 先コンテンツ、いわゆる精子先体反応³⁷, 4) 透明帯と 5 貫通) 受精³⁸を完了する卵膜と融合。手順を通過し、卵子を受精させることができる、精子細胞に精子¹¹、精子細胞”decapacitating”の要因³⁹を含む精液を残すし、女性の流体に泳ぐとして始まりまず受ける必要があります。重炭酸塩およびアルブミンの³⁷の高レベルの生殖器。精子は、精子細胞の陰嚢、鞭毛と精子先体反応³⁷の積極的な打撃と運動の形を受けることをレンダリングします。Hyperactivated 運動は、⁴⁰の透明帯の浸透のため、先にこの浸透プロセス⁴¹を支援する様々 な加水分解酵素が含まれています。さらに、先体反応は精子細胞を精子卵融合⁴²に必要な精子表面の特定の膜タンパク質を公開することによって、卵と融合させるが可能なレンダリングします。その結果、陰嚢と先体反応を受けるための能力は、正常な受精卵^40,42のために必要な両方。マウス精子細胞^43,44,45見られているものに反して精子そのまま唯一の人間の精子は透明帯⁴⁶にバインドできます。人間の精子が透明帯にバインドされたとき彼らは⁴¹透明帯を貫通して卵³⁸との融合のために必要な特定の膜タンパク質を公開する先体反応を受けなければなりません。ひと精子先体反応のタイミング、受精が発生するために重要です。

前述の通り、Ca^{2 +}-重要な信号が正常な精子細胞機能⁸、それは、したがって、画面多数 Ca^{2 +}の効果のための化合物のことができるの関心-ひと精子細胞におけるシグナル伝達します。同様に、適切なタイミングと場所で精子先体反応を受ける唯一の人間の精子は透明帯を貫通でき、受精卵^46,47、だもする機能のための化合物をテストすることができるの関心ひと精子先体反応に影響を与えます。このため、2 つの培地スクリーニング アッセイが記載されて: 1) Ca^{2 +}の影響の分析-人間の精子細胞と 2) ひと精子先体反応を誘導する能力のアッセイのシグナルします。

1 の試金は媒体スループット Ca^{2 +}-アッセイをシグナリングします。この蛍光プレート リーダー ベースの技術は、複数の井戸で同時に時間の関数としての蛍光性の変更を監視します。Ca^{2 +}-敏感な蛍光染料、蛍光色 4 は Ca^{2 +}≒ 335 の K_d nM、AM (アセトキシメチルセファロスポリン) エステル フォームのセル側の透過を物。蛍光色 4 を使用すると、時間が経つと精子細胞に関心の化合物の添加後に [Ca^{2 +}]_iの変化を測定することが可能です。アッセイ 2011年¹³ティモ ・ Strünker の研究室で開発された、以来 Ca^{2 +}の効果のための化合物の画面にいくつかの研究で使用されています-ひと精子^{1,2,3、シグナル伝達 4,5}。同様のメソッドは、複数の薬物候補⁴⁸を画面に使用されています。さらに、この試金はアクション^1,2,3,4,の⁵用量-反応曲線^{1、薬理学的モードを評価するために有用なも 2,3,4、5}、競争阻害^1,2加法^1,2、および相乗作用³興味の化合物。

2 の試金は媒体スループット精子先体反応アッセイです。この画像の cytometer ベース技術対策実行可能な量精子先体反応 3 つの蛍光染料を使用して、サンプルの精子細胞: propidium ヨウ化 (PI) エンドウ (FITC PSA) とヘキスト 33342 の FITC 結合レクチン。試金は Zoppino ら⁴⁹によって似たような流れの cytometry ベースのメソッドから変更され、いくつか研究^6,7で使用されています。Ca^{2 +}は-シグナリング アッセイは、この先体反応アッセイは興味の化合物の相乗効果、加法性、阻害用量反応曲線を評価するためにも使えます。

Protocol

コレクションとプロトコルで人間の精液のサンプル解析デンマーク首都地域の研究倫理委員会のガイドラインに従います。すべての精液サンプルは、インフォームド コンセント後ボランティア ドナーから得られています。出産後、サンプルが完全に匿名化。迷惑の各ドナーはサンプルにつき 500 DKK (約 $75 米国. ドル) の手数料を受け取った。サンプル配信の日に分析し、実験後すぐに破棄さ?…

Representative Results

代表中 Ca2 +によるひと精子テスト陽性 (プロゲステロン) と負 (バッファー) コントロール [Ca2 +]i 4 化合物 (A、B、C、および D) の効果実験からの結果-シグナルアッセイは、図 4 aで見ることができます。図 4 bでプロゲステロンの用量応答曲線が現れ、ピーク ΔF/F0 (%) から派生しました。プロゲ…

Discussion

中スループット Ca^{2 +}シグナリング アッセイは単一マイクロウェルから蛍光の測定に基づいて約 250,000 の精子細胞を含みます。取込んだ信号もすべて細胞精子の平均です。アッセイにより空間情報について具体的には、精子細胞 [Ca^{2 +}]_私は変更されず、[Ca^{2 +}]_iの変更になります場所、または異種の応答は精子細胞の大きさの割合で間個々 のセル。このよ…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer