Средне-пропускная способность, отбор проб для оценки воздействия на Ca2 +-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы

Summary

Здесь, две средних-пропускная способность анализов для оценки воздействия на Ca^{2 +}-описаны сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы. Эти анализы могут использоваться для экрана быстро и легко большое количество соединений для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы.

Abstract

CA^{2 +}-сигнализации имеет важное значение для функции нормальных клеток спермы и мужской фертильности. Аналогично реакция Акросома имеет жизненно важное значение для способности человека сперматозоид проникает вителлинового и оплодотворить яйцеклетку. Именно поэтому представляет большой интерес для проверки соединений (например, экологические химических веществ или наркотиков кандидатов) за их влияние на Ca^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы либо для изучения потенциального неблагоприятного воздействия на человека сперматозоид функции или для изучения возможной роли в качестве средства контрацепции. Здесь описаны два анализов средне-пропускная способность: 1) на основе флуоресценции assay для оценки воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации в человеческой спермы и 2) изображения гранулярных assay для оценки реакции Акросома в человеческой спермы. Эти анализы могут использоваться для экран большое количество соединений для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы. Кроме того анализов может использоваться для создания узкоспециализированных доза реакция кривых индивидуальных соединений, определить потенциальные аддитивности/синергизм для соединения двух или более и для изучения режима фармакологических действий путем конкурентного ингибирования эксперименты с ингибиторами CatSper.

Introduction

Цель двух анализов, описанные здесь является изучить воздействие на Ca^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции в человеческой спермы, как уже было показано для нескольких соединений в ряде публикаций, используя эти assays^{1,2, 3,4,5,6,7}. CA^{2 +}-сигнализации и Акросома реакции являются жизненно важное значение для нормального человека сперматозоид функцию и плодовитость мужчины.

Общая цель клетки спермы человека заключается в том, чтобы оплодотворить яйцеклетку. Чтобы иметь возможность успешно и естественно оплодотворить яйцеклетку, функции клетки спермы должно регулироваться плотно во время путешествия сперматозоид через женского репродуктивного тракта^8,9. Многие из функций клеток спермы регулируются через внутриклеточные Ca^{2 +}-концентрация [Ca^{2 +}]_я (например, спермы моторики, хемотаксис и Акросома реакции)¹⁰. Кроме того процесс созревания, называется капацитации, который оказывает сперматозоид способен подкормки яйцо, это частично регулируется [Ca^{2 +}],_я¹⁰. CA^{2 +}-экструзия Ca^{2 +}-АТФазы насосы¹¹ поддерживать приблизительно 20.000 раза Ca^{2 +}-градиента над человеческой спермы клеточной мембраны, с отдыха [Ca^{2 +}]_я 50-100 Нм. Если Ca^{2 +} разрешается пересекать клеточной мембраны (например, путем открытия Ca^{2 +}-каналы), значительный приток Ca^{2 +} происходит, что приводит к высоте [Ca^{2 +}]_я. Однако, также носит сперматозоид внутриклеточных Ca^{2 +}-магазины, которые могут освободить Ca^{2 +} и, таким образом, также дать подняться над уровнем моря [Ca^{2 +}]_я¹². Интересно, что все канал опосредованной Ca^{2 +}-приток в клетках человека спермы до настоящего времени были найдены происходят через CatSper (Catионный канал Sperm), который только выражается в сперматозоиды¹¹. В клетках человека спермы, CatSper активируется эндогенные лиганды прогестерона и простагландинов через собственный лигандом привязки сайтов^13,14,15, приводит к быстрому Ca^{2 +}-приток в сперматозоид. Два основных источника возле яйца обеспечивают высокий уровень эти эндогенные лиганды. Один является фолликулярная жидкость, которая содержит высокий уровень прогестерона¹⁶. Фолликулярная жидкость освобождается от зрелых фолликулов вместе с яйцо в овуляции и смешивается с жидкостью в пределах яйцеводов¹⁷. Другим основным источником является кучевые клетки, которые окружают яйцо и освободить высокий уровень прогестерона и простагландинов. Прогестерон индуцированной Ca^{2 +}-приток в клетки спермы было показано посредником хемотаксис к яйцо^9,18, контролировать^19,подвижности сперматозоидов²⁰ и стимулировать Акросома ²¹реакция. Срабатывание этих отдельных [Ca^{2 +}]_я-регулируемые спермы функций в правильном порядке и в нужное время имеет решающее значение для оплодотворения яйцеклетки⁸. В соответствии с этим, субоптимальный прогестерон индуцированной Ca^{2 +}-приток был найден ассоциируется с снижением мужской фертильности^{22,23,24,25,26 ,27,,2829} и функциональных CatSper имеет важное значение для мужской плодовитости^{26,30,,3132, 33,34,35,36}.

Как сперматозоиды достигают яйцо, последовательность событий должны иметь место для оплодотворение происходит: 1 клетки спермы должны проникнуть окружающие отель cumulus слоя клеток, 2) привязки к zona pellucida, 3) exocytose акросомной содержание, так называемый Акросома реакции ³⁷, 4) проникают zona pellucida и 5) предохранитель с яйцо мембраны для завершения оплодотворение³⁸. Чтобы иметь возможность пройти через эти шаги и оплодотворить яйцеклетку, сперматозоид должны сначала пройти капацитации¹¹, которая начинается как клетки спермы оставить семенной жидкости, содержащие «decapacitating» факторов³⁹ и плавать в жидкости самка репродуктивного тракта с высоким уровнем бикарбоната и альбумина³⁷. Капацитации выносит сперматозоиды могут пройти гиперактивацию, форма подвижности с энергичной избиение жгутика, и Акросома реакции³⁷. Гиперактивными подвижности требуется для проникновения в zona pellucida⁴⁰, и Акросома содержит различные гидролитических ферментов, которые помогают этот процесс проникновения⁴¹. Кроме того реакция Акросома отрисовывает клетки спермы, способных слияния с яйцом, подвергая конкретных мембранных белков на поверхности сперматозоидов необходимых для спермы яйцо фьюжн⁴². Следовательно, возможность пройти гиперактивацию и Акросома реакции, так необходимых для успешного оплодотворения яйцеклетки^40,42. Вопреки тому, что видел для мыши сперматозоиды^43,,4445только человеческие сперматозоиды, которые сохранились Акросома можно привязать к zona pellucida⁴⁶. Когда человека клетки спермы привязаны к zona pellucida, они должны пройти Акросома реакции как проникнуть вителлинового⁴¹ , так и для предоставления конкретных мембранных белков, которые необходимы для синтеза с яйцо³⁸. Таким образом, время реакции Акросома в человеческой спермы имеет решающее значение для оплодотворение произойти.

Как описано выше, Ca^{2 +}-сигнализации имеет жизненно важное значение для нормальной спермы функция⁸, и это, следовательно, большой интерес для экрана большого числа соединений для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации в человеческих клеток спермы. Точно так же как только человеческие сперматозоиды, которые проходят Акросома реакции в нужное время и место может проникнуть вителлинового и оплодотворить яйца^46,47, это также большой интерес, чтобы иметь возможность проверить соединения на их способность влияет на Акросома реакции в человеческой спермы. С этой целью, описаны два скрининга средне-пропускная способность анализов: 1) assay для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации в человеческие сперматозоиды и 2) assay для получения возможности побудить Акросома реакции в человеческих клеток спермы.

Проба 1 является средне-пропускная способность Ca^{2 +}-сигнализации assay. Этот метод на основе чтения флуоресценции пластины отслеживает изменения в флуоресцировании как функцию от времени одновременно в нескольких скважин. Ca^{2 +}-чувствительных Люминесцентную краску, Fluo-4 имеет K_d для Ca^{2 +}≈ 335 Нм и клеток permeant в форме Эстер AM (acetoxymethyl). С помощью флуоресцентного-4, это можно измерить изменения в [Ca^{2 +}]_я со временем и после добавления соединений, представляющих интерес для клеток спермы. Проба была разработана лабораторией Timo Strünker в 2011¹³ и с тех пор был использован в нескольких исследованиях на экране соединений для воздействия на Ca^{2 +}-сигнализации в человеческой спермы^{1,2,3, 4,5}. Также подобный метод использовался для экран несколько наркотиков кандидатов⁴⁸. Кроме того этот assay также полезна для оценки режима фармакологических действий^1,2,3,4,5,^{, доза реакция кривых1 2,3,4,5}, конкурентного ингибирования^1,2, аддитивности^1,2и³ синергизм соединений, представляющих интерес.

Проба 2 относится средне-пропускная способность Акросома реакции. Этот метод на основе цитометр изображения измеряет количество жизнеспособных отреагировали Акросома сперматозоидов в выборке, используя три Краски люминесцентные, флуоресцентные: пропидий йодидом (PI), FITC-сочетании Лектин Pisum sativum (FITC-PSA) и Hoechst 33342. Проба была изменена от аналогичного метода на основе цитометрии потока Zoppino et al.⁴⁹ и был использован в нескольких исследованиях^6,7. Что касается Ca^{2 +}-сигнализации пробирного, этот assay Акросома реакция может также использоваться для оценки доза реакция кривых, ингибирование, аддитивности и синергизм соединений, представляющих интерес.

Protocol

Сбор и анализ образцов человеческой спермы в протоколах соответствует руководящим принципам Комитета по этике исследований столицы региона Дании. Все образцы спермы были получены после информированного согласия от безвозмездных доноров. После родов образцы были полностью анонимным…

Representative Results

Представитель результаты эксперимента, тестирование эффект 4 соединений (A, B, C и D) вместе с положительным (Прогестерон) и отрицательной (буфер) управления на [Ca2 +]я в человеческой спермы с использованием средне-пропускная способность Ca2 +-сигнализации п…

Discussion

Средняя пропускная способность Ca^{2 +} сигнализации что проба основана на измерениях флуоресценции от одного microwells содержит около 250.000 клеток спермы. В среднем захваченного сигнала от всех отдельных клеток спермы в колодец. Assay таким образом обеспечивает что никакой пространственно…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer