Rendimiento medio de selección de ensayos para la evaluación de efectos sobre la Ca2 +-señalización y reacción acrosómica en espermatozoides humanos

Summary

Aquí, dos ensayos de rendimiento medio para la evaluación de efectos sobre la Ca^{2 +}-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos se describen. Estos ensayos se pueden utilizar para rápidamente y fácilmente grandes cantidades de compuestos de efectos sobre la Ca^{2 +}-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos.

Abstract

CA^{2 +}-señalización es esencial para la función normal de la célula de la esperma y la fertilidad masculina. Del mismo modo, la reacción acrosómica es vital para la capacidad de un espermatozoide humano penetrar la zona pelúcida y fertilizar el óvulo. Por lo tanto es de gran interés para probar compuestos (por ejemplo, químicos ambientales o medicamentos) para su efecto sobre el Ca^{2 +}-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos para examinar los posibles efectos adversos en función de las células de esperma humano o investigar un posible papel como un anticonceptivo. Aquí, se describen dos ensayos de mediano rendimiento: 1) un análisis basado en la fluorescencia para la evaluación de efectos sobre la Ca^{2 +}-señalización en espermatozoides humanos y 2) un análisis de citometría de imagen para la evaluación de la reacción acrosómica en espermatozoides humanos. Estos ensayos pueden utilizarse para un gran número de compuestos de efectos sobre la Ca^{2 +}de la pantalla-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos. Además, el análisis pueden ser utilizados para generar las curvas dosis-respuesta altamente específica de compuestos individuales, determinar la posible aditividad/sinergismo de dos o más compuestos y estudiar el modo farmacológico de acción mediante la inhibición competitiva experimentos con los inhibidores de CatSper.

Introduction

El propósito de los dos ensayos descritos aquí es examinar los efectos sobre la Ca^{2 +}-reacción señalización y acrosómica en espermatozoides humanos, como ha sido demostrado por múltiples compuestos en varias publicaciones que emplean estos ensayos de^{1,2, 3,4,5,6,7}. CA^{2 +}-señalización y la reacción del acrosoma son función de las células de esperma humano vital para normal y la fertilidad masculina.

El objetivo general de una célula de la esperma humana es fertilizar el óvulo. Para poder naturalmente y con éxito fertilizar el óvulo, las funciones de la célula de la esperma deben regularse bien durante el viaje de la célula de la esperma a través del tracto reproductor femenino^8,9. Muchas de las funciones de la célula de la esperma son regulados por el Ca intracelular^{2 +}-concentración [Ca^{2 +}] (por ejemplo, esperma motilidad, quimiotaxis y acrosoma reacción)¹⁰. También, un proceso de maduración llamado capacitación, que hace el espermatozoide capaz de fecundar el óvulo, es regulada en parte por [Ca^{2 +}]¹⁰. CA^{2 +}-extrusión de Ca^{2 +}-ATPase bombas¹¹ mantener un doblez de aproximadamente 20.000 Ca^{2 +}-gradiente sobre la membrana del espermatozoide humano, con un descanso [Ca^{2 +}] de 50-100 nM. Si Ca^{2 +} se permite cruzar la membrana celular (por ejemplo, mediante la apertura de Ca^{2 +}-canales), se produce una considerable afluencia de Ca^{2 +} , dando lugar a una elevación de la [Ca^{2 +}]. Sin embargo, la célula de la esperma también lleva intracelular Ca^{2 +}-tiendas, las cuales pueden liberar Ca^{2 +} y, por lo tanto, también dan una elevación de la [Ca^{2 +}]_i¹². Curiosamente, todas mediadas por canales Ca^{2 +}-afluencia en espermatozoides humanos hasta ahora se ha encontrado para ocurrir a través de CatSper (Catcanal iónico de rm de Spe), que se expresa sólo en células de la esperma¹¹. En las células de esperma humanas, CatSper es activado por los ligandos endógenos progesterona y prostaglandinas a través de distinta ligando vinculante sitios^13,14,15, llevando a una rápida Ca^{2 +}-afluencia en la célula de la esperma. Dos fuentes principales cerca de los huevos proporcionan altos niveles de estos ligandos endógenos. Uno es el líquido folicular que contiene altos niveles de progesterona¹⁶. Se libera el líquido folicular de folículos maduros junto con el óvulo en la ovulación y se mezcla con el líquido dentro de los oviductos¹⁷. La otra fuente principal es las células del cúmulo que rodean el huevo y liberan altos niveles de progesterona y prostaglandinas. La progesterona inducida por Ca^{2 +}-afluencia en las células de esperma se ha demostrado para mediar la quimiotaxis hacia el huevo^9,18, control de esperma motilidad^19,20 y estimular el acrosoma reacción²¹. El accionar de estos individuales [Ca^{2 +}]-funciones de esperma regulado en el orden correcto y en el momento correcto es crucial para la fertilización del huevo⁸. En consonancia con esto, un subóptimo inducida por la progesterona Ca^{2 +}-afluencia se ha encontrado asociada con reducir la fertilidad masculina^{22,23,24,25,26 ,27,28,29} y funcional CatSper es esencial para la fertilidad masculina^{26,30,31,32, 33,34,35,36}.

Como los espermatozoides alcanzar el óvulo, una secuencia de eventos debe ocurrir para que ocurra la fertilización: 1) los espermatozoides deben penetrar la capa circundante de células cumulus, 2) se unen a la zona pelúcida, 3) exocytose el contenido acrosómica, la reacción de acrosoma supuesto ³⁷, 4) penetrar la zona pelúcida y 5) se fusionan con la membrana del huevo para completar la fertilización³⁸. Para poder pasar por estos pasos y fertilizar el óvulo, la célula de la esperma primero debe someterse a capacitación¹¹, que comienza cuando las células de esperma salir el fluido seminal contiene factores “decapacitating”³⁹ y nadar en los fluidos de la mujer tracto reproductivo con altos niveles de bicarbonato y albúmina³⁷. Capacitación hace que los espermatozoides capaces de someterse a hyperactivation, una forma de movilidad con una enérgica paliza de flagelo y reacción de acrosoma³⁷. Ligerament la motilidad es necesaria para la penetración de la zona pelúcida⁴⁰, y el acrosoma contiene diversas enzimas hidrolíticas que ayudan a este proceso de penetración⁴¹. Además, la reacción de acrosoma representa los espermatozoides capaces de fusionarse con el huevo mediante la exposición de proteínas de membrana específicas en la superficie de espermatozoides necesaria para la fusión de esperma huevo⁴². En consecuencia, la capacidad de experimentar la reacción hyperactivation y acrosoma son ambos necesarios para la fertilización exitosa de los huevos^40,42. Contrario a lo que se ha visto para las células espermáticas de ratón^43,44,45, sólo humanas células de esperma que son acrosoma intacto puede enlazar a la zona pelúcida⁴⁶. Cuando las células de esperma humanas están limitadas a la zona pelúcida tienen que sufrir la reacción acrosómica para penetrar la zona pelúcida⁴¹ y exponer proteínas de membrana específicas que son necesarias para la fusión con el huevo³⁸. El momento de la reacción acrosómica en espermatozoides humanos así es crítico para que ocurra la fertilización.

Como se describió anteriormente, Ca^{2 +}-señalización es vital para espermatozoides normales la célula función⁸, y es, por tanto, de gran interés para poder a un gran número de pantalla compuestos por efectos sobre la Ca^{2 +}-señalización en las células de esperma humanas. Del mismo modo, como único humanos espermatozoides que sufren la reacción acrosómica en el lugar y momento adecuado pueden penetrar la zona pelúcida y fertilizar el huevo^46,47, también es de gran interés para poder probar los compuestos por su capacidad para afectan la reacción acrosómica en espermatozoides humanos. Para ello, se describen dos ensayos de cribado de mediano rendimiento: 1) un análisis de efectos sobre la Ca^{2 +}-señalización en las células de esperma humanas y 2) un ensayo para determinar la capacidad de inducir la reacción acrosómica en espermatozoides humanos.

Ensayo 1 es a medio rendimiento Ca^{2 +}-ensayo de señalización. Esta técnica basada en el lector de fluorescencia placa controla los cambios en la fluorescencia como una función de tiempo simultáneamente en varios pozos. El Ca^{2 +}-colorante fluorescente sensible, Fluo-4 tiene una K_d de Ca^{2 +}≈ 335 nM y es florescente de la célula en forma de éster de AM (acetoxymethyl). Utilizando Fluo-4, es posible medir los cambios en la [Ca^{2 +}]_i con el tiempo y después de la adición de compuestos de interés para los espermatozoides. El análisis fue desarrollado por el laboratorio de Timo Strünker en 2011¹³ y desde entonces se ha utilizado en varios estudios a compuestos de la pantalla de efectos sobre la Ca^{2 +}-señalización en espermatozoides humanos^{1,2,3, 4,5}. También se ha utilizado un método similar para múltiples drogas candidatos⁴⁸. Además, este ensayo también es útil para evaluar el modo farmacológico de acción^1,2,3,4,5, las curvas de dosis-respuesta^{1, 2,3,4,5}, inhibición competitiva^1,2, aditividad^1,2y³ de la sinergia de compuestos de interés.

2 el análisis es un análisis de la reacción acrosómica de mediano rendimiento. Esta técnica basada en la citometría de imagen mide la cantidad de viable acrosoma reaccionado espermatozoides en una muestra, usando tres colorantes fluorescentes: yoduro de propidio (PI), acoplado a FITC lectina Pisum sativum (PSA-FITC) y Hoechst 33342. El ensayo fue modificado de un método basado en la citometría de flujo similar por Zoppino et al⁴⁹ y ha sido utilizado en varios estudios^6,7. En cuanto a la Ca^{2 +}-señalización ensayo, este análisis de la reacción de acrosoma también podrían usarse para evaluar las curvas dosis-respuesta, inhibición, aditividad y sinergia de los compuestos de interés.

Protocol

La recogida y análisis de muestras de semen humano en los protocolos sigue las directrices de la Comisión de ética de investigación de la región Capital de Dinamarca. Todas las muestras de semen se han obtenido después de consentimiento informado de los donantes voluntarios. Después de la entrega, las muestras fueron totalmente anonimizadas. Por sus molestias, cada donante recibió un honorario de 500 coronas danesas (unos 75 dólares) por muestra. Las muestras fueron analizadas en el día de la entrega y luego de…

Representative Results

Representante de los resultados de un experimento que prueba el efecto de 4 compuestos (A, B, C y D) con un positivo (progesterona) y un control negativo (tampón) de [Ca2 +]i en espermatozoides humanos con rendimiento medio Ca2 +-señalización Análisis puede verse en la figura 4a. En la Figura 4b, se muestra una curva de respuesta de dosis de progesterona, que se deriva de pico ΔF/F0</sub…

Discussion

El rendimiento medio Ca^{2 +} señalización de ensayo se basa en las mediciones de fluorescencia de solo micropocillos que contiene unos 250.000 células de la esperma. La señal capturada es un promedio de todas las células individuales de la esperma en el pozo. El ensayo proporciona así que ninguna información espacial acerca de dónde específicamente en la célula de la esperma [Ca^{2 +}] es cambiada, en gran proporción de las células de esperma un cambio en la [Ca^{2 +}]_…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer