Medio-throughput Screening Test per la valutazione degli effetti sulla Ca2 +-segnalazione e reazione acrosomiale in sperma umano

Summary

Qui, due saggi di medio-velocità effettiva per la valutazione degli effetti su Ca^{2 +}-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano sono descritti. Queste analisi possono essere utilizzate per rapidamente e facilmente a schermo grandi quantità di composti per effetti su Ca^{2 +}-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano.

Abstract

CA^{2 +}-segnalazione è essenziale per la funzione normale delle cellule dello sperma e la fertilità maschile. Allo stesso modo, la reazione acrosomiale è vitale per la capacità di una cellula di sperma umana di penetrare la zona pellucida e fecondare l’uovo. È quindi di grande interesse per testare composti (per esempio, sostanze chimiche ambientali o candidati farmaci) per il loro effetto su Ca^{2 +}-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano sia per esaminare i potenziali effetti negativi sulla funzione delle cellule dello sperma umano o per indagare su un possibile ruolo come contraccettivo. Qui sono descritti due saggi di media-velocità di trasmissione: 1) un’analisi di fluorescenza-basata per la valutazione degli effetti su Ca^{2 +}-segnalazione in sperma umano e 2) un’analisi cytometric di immagine per la valutazione della reazione acrosomiale in sperma umano. Queste analisi possono essere utilizzate per lo screening di un gran numero di composti per effetti su Ca^{2 +}-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano. Inoltre, l’analisi possono essere utilizzate per generare le curve dose-risposta altamente specifici dei singoli composti, determinare il potenziale additività/sinergismo per due o più composti e per studiare il modo farmacologico di azione attraverso l’inibizione competitiva esperimenti con gli inibitori CatSper.

Introduction

Lo scopo dei due saggi qui descritto è quello di esaminare gli effetti su Ca^{2 +}-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano, come è stato dimostrato per molteplici composti in diverse pubblicazioni che impiegano questi dosaggi^{1,2, 3,4,5,6,7}. CA^{2 +}-segnalazione e la reazione acrosomiale sono entrambi funzione vitale al normale umano delle cellule dello sperma e fertilità maschile.

L’obiettivo generale di uno spermatozoo umano è quella di fecondare l’uovo. Per poter correttamente e naturalmente fecondare l’uovo, le funzioni della cellula dello sperma devono essere regolate strettamente durante il viaggio della cellula dello sperma attraverso il tratto riproduttivo femminile^8,9. Molte delle funzioni delle cellule dello sperma sono regolati tramite intracellulare Ca^{2 +}-concentrazione [Ca^{2 +}]_i (ad es., spermatozoi motilità, chemiotassi e acrosomiale reazione)¹⁰. Inoltre, un processo di maturazione chiamato capacitazione, che rende la cellula dello sperma in grado di fecondare l’uovo, è parzialmente regolamentato da [Ca^{2 +}]_i¹⁰. CA^{2 +}-estrusione Ca^{2 +}-ATPase pompe¹¹ mantenere una piega circa 20.000 Ca^{2 +}-gradiente sopra la membrana delle cellule dello sperma umano, con un riposo [Ca^{2 +}]_io di 50-100 nM. Se Ca^{2 +} è consentito di attraversare la membrana cellulare (ad esempio, attraverso l’apertura di Ca^{2 +}-canali), si verifica un considerevole afflusso di Ca^{2 +} , dando luogo a un’altitudine di [Ca^{2 +}]_i. Tuttavia, la cellula dello sperma inoltre trasporta intracellulare di Ca^{2 +}-negozi, che possono liberare Ca^{2 +} e, di conseguenza, anche il danno luogo un’elevazione della [Ca^{2 +}]_i¹². Interessante, tutti i canali-mediata Ca^{2 +}-afflusso in cellule dello sperma umane finora è stato trovato per accadere via CatSper (gattocanale ionico di rm Spe), che è espresso solo in cellule spermatiche¹¹. In cellule umane di sperma, CatSper viene attivato dal progesterone ligandi endogeni e prostaglandine attraverso distinto ligando vincolanti siti^13,14,15, portando a un rapido Ca^{2 +}-afflusso in le cellule di sperma. Due principali fonti vicino l’uovo forniscono alti livelli di questi ligandi endogeni. Uno è il liquido follicolare che contiene alti livelli di progesterone¹⁶. Il liquido follicolare viene rilasciato da follicoli maturi insieme con l’uovo all’ovulazione e si mescola con il liquido all’interno del ovidotti¹⁷. L’altra fonte principale è le cellule del cumulo che circondano l’uovo e il rilascio di alti livelli di progesterone e prostaglandine. Il progesterone-indotto Ca^{2 +}-afflusso in cellule dello sperma è stato indicato per mediare chemiotassi verso l’uovo^9,18, controllo della motilità dello sperma^19,20 e stimolare l’acrosomiale reazione a²¹. Attivazione di questi singoli [Ca^{2 +}]_i-funzioni di sperma regolamentato nell’ordine corretto e al momento giusto è fondamentale per la fecondazione dell’ uovo⁸. In linea con questo, suboptimale indotta da progesterone Ca^{2 +}-afflusso è stato trovato per essere associato con ridotta fertilità maschile^{22,23,24,25,26 ,27,28,29} e CatSper funzionale è essenziale per la fertilità maschile^{26,30,31,32, 33,34,35,36}.

Come gli spermatozoi raggiungere l’uovo, una sequenza di eventi deve avvenire per avvenire la fertilizzazione: 1) le cellule dello sperma deve penetrare lo strato di cellule cumulus circostante, 2) associare alla zona pellucida, 3) exocytose il contenuto acrosomale, la reazione acrosomiale cosiddetto ³⁷, 4) penetrare la zona pellucida e 5) si fondono con la membrana dell’uovo per completare la fecondazione³⁸. Per essere in grado di passare attraverso questi passaggi e fecondare l’ovulo, la cellula dello sperma deve prima subire capacitazione¹¹, che comincia come cellule dello sperma lasciare il liquido seminale contenente “decapacitating” fattori³⁹ e nuotare nei fluidi della femmina tratto riproduttivo con alti livelli di bicarbonato e l’albumina³⁷. Capacitazione rende gli spermatozoi in grado di subire iperattivazione, una forma di motilità con un battente vigorosa del flagello e di reazione acrosomiale³⁷. Motilità iperattivata è necessaria per la penetrazione della zona pellucida⁴⁰e acrosomiale contiene vari enzimi idrolitici che gli aiuti di questo processo di penetrazione⁴¹. Inoltre, la reazione acrosomiale rende gli spermatozoi capaci di fondere con l’uovo esponendo proteine specifiche della membrana sulla superficie degli spermatozoi necessaria per sperma-uovo fusione⁴². Di conseguenza, la capacità di subire la reazione acrosomiale iperattivazione sono entrambi necessari per la fecondazione dell’uovo^40,42. Contrariamente a quanto visto per mouse spermatozoi^43,44,45, solo umano delle cellule dello sperma che sono acrosomiale intatta possibile associare alla zona pellucida⁴⁶. Quando le cellule di sperma umane sono limitate alla zona pellucida devono subire la reazione acrosomiale sia per penetrare la zona pellucida⁴¹ ed esporre proteine di membrana specifici che sono necessari per la fusione con l’ uovo³⁸. La tempistica della reazione acrosomiale in sperma umano è così critica per avvenire la fertilizzazione.

Come descritto in precedenza, Ca^{2 +}-segnalazione è vitale per spermatozoi normali delle cellule funzione⁸, ed è, quindi, di grande interesse per essere in grado di grandi numeri di schermo di composti per effetti su Ca^{2 +}-segnalazione in cellule di sperma umane. Allo stesso modo, solo umano delle cellule dello sperma che subiscono reazione acrosomiale al momento giusto e nel luogo può penetrare la zona pellucida e fecondare l’uovo^46,47, è anche di grande interesse per essere in grado di testare composti per la loro capacità di influenzare la reazione acrosomiale in sperma umano. A tal fine, sono descritti due saggi di screening medio-resa: 1) un test per effetti su Ca^{2 +}-segnalazione in cellule dello sperma umane e 2) un test per la capacità di indurre la reazione acrosomiale in cellule umane di sperma.

Dosaggio 1 è un mezzo-rendimento Ca^{2 +}-saggio di segnalazione. Questa tecnica basata su lettore di fluorescenza piastra controlla le modifiche in fluorescenza in funzione del tempo contemporaneamente in pozzi multipli. Il Ca^{2 +}-sensibili colorante fluorescente, Fluo-4 ha un K_d per Ca^{2 +}≈ 335 nM ed è cellula-permeante sotto forma di estere AM (acetossimetil). Utilizzando Fluo-4, è possibile misurare le variazioni di [Ca^{2 +}]_i , nel corso del tempo e dopo l’aggiunta di composti di interesse per le cellule dello sperma. Il dosaggio è stato sviluppato dal laboratorio di Timo Strünker nel 2011¹³ e da allora è stato utilizzato in parecchi studi ai composti di schermo per effetti su Ca^{2 +}-segnalazione in sperma umano^{1,2,3, 4,5}. Inoltre è stato utilizzato un metodo simile allo schermo più droga candidati⁴⁸. Inoltre, questo test è anche utile per valutare la modalità farmacologica dell’azione^1,2,3,4,5, di curve dose-risposta^{1, 2,3,4,5}, inibizione competitiva^1,2, additività^1,2e sinergismo³ di composti di interesse.

Metodo 2 è un reazione acrosomiale medio-velocità di trasmissione. Questa tecnica di immagine basati su citometro misura la quantità di vitali acrosomiale ha reagito spermatozoi in un campione, utilizzando tre coloranti fluorescenti: ioduro di propidio (PI), accoppiati a FITC lectina di Pisum sativum (FITC-PSA) e Hoechst 33342. Il dosaggio è stato modificato da un simile metodo basato su cytometry di flusso da Zoppino et al.⁴⁹ ed è stato utilizzato in diversi studi^6,7. Per quanto riguarda il Ca^{2 +}-segnalazione test, questo saggio di reazione acrosomiale potrebbe essere utilizzato anche per valutare le curve dose-risposta, inibizione, additività e sinergismo di composti di interesse.

Protocol

La raccolta e l’analisi di campioni di liquido seminale umano nei protocolli segue le linee guida del comitato etico di ricerca della regione di Hovedstaden. Tutti i campioni di seme sono stati ottenuti dopo consenso informato da donatori volontari. Dopo la consegna, i campioni sono stati completamente anonimi. Per loro disagi ogni donatore ha ricevuto un compenso di 500 DKK (circa $75 dollari USA) per campione. I campioni sono stati analizzati il giorno della consegna e poi distrutti immediatamente dopo gli esperimenti …

Representative Results

Rappresentante risultati da un esperimento per verificare l’effetto di 4 composti (A, B, C e D) unitamente ad una positiva (progesterone) e un controllo negativo (buffer) sulla [Ca2 +]i in sperma umano utilizzando la velocità media effettiva Ca2 +-segnalazione dosaggio può essere visto in Figura 4a. In Figura 4b, viene visualizzata una curva dose-risposta di progesterone, che è stato derivato d…

Discussion

La velocità effettiva media Ca^{2 +} segnalazione di analisi è basata sulla misura della fluorescenza da singoli pozzetti ogni contenente circa 250.000 cellule dello sperma. Il segnale acquisito è in media da tutte le singole celle di sperma nel pozzo. Il dosaggio fornisce così che non spaziali informazioni su dove in particolare la cellula dello sperma [Ca^{2 +}]_i sono modificati, in quanto grande una proporzione delle cellule dello sperma avviene un cambiamento in [Ca^{2 +}]_i…

Materials

0.2 µm pore filter	Thermo Fisher Scientific, USA	296-4545
1 L measuring cylinder	Thermo Fisher Scientific, USA	3662-1000
1,4 and 2 mL plastic tubes	Eppendorf, Germany	30120086 and 0030120094
12-channel pipette	Eppendorf, Germany	4861000813
384 multi-well plates	Greiner Bio-One, Germany	781096
15 and 50 mL platic tubes	Eppendorf, Germany	0030122151 and 30122178
A2-slide	ChemoMetec, Denmark	942-0001
Automatic repeater pipette	Eppendorf, Germany	4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA)	Sigma-Aldrich, Germany	L0770
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific, USA	F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader	BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342	ChemoMetec, Denmark	910-3015
Human serum albumin (HSA)	Irvine Scientific	9988	For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer	ChemoMetec, Denmark	970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI)	ChemoMetec, Denmark	910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer	ChemoMetec, Denmark	910-0101
SP1-cassette	ChemoMetec, Denmark	941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer