哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強
Summary
HeLa 細胞を用いた哺乳類細胞周期中に二本鎖 RNA 結合蛋白質キナーゼ rna (PKR) 勉強 RNA インターアクターのための実験的アプローチを提案します。このメソッドは、クロスリンク RNA PKR 錯体と PKR バインド Rna を豊かにする免疫沈降にホルムアルデヒドを利用しています。これらの Rna は、高スループット シーケンスまたは qRT PCR からさらに分析できます。
Abstract
タンパク質キナーゼ (PKR) rna は生得の免疫反応蛋白質のメンバーであるし、ウイルス Rna の二重鎖の二次構造を認識します。ウイルスの二本鎖 Rna (二本) にバインドされると、PKR は二量体化とそれに続く自己リン酸化を受けます。リン酸化 PKR (pPKR) はアクティブになり、真核生物の開始因子 2 (神経: Eif2) グローバル翻訳を抑制する α サブユニットのリン酸化を誘導します。増加する証拠を PKR を細胞周期の間に生理学的な条件の下で、または感染せず様々 なストレス条件下で起動できるかを示唆しています。しかし、pkr からの RNA の活性剤の私達の理解はキャプチャし、二本の pkr から相互作用を分析する標準化された実験方法の不足のために限られました。ここでは、提案する実験的具体的に豊かにし、PKR を分析するためのプロトコルは HeLa 細胞を用いた細胞周期中に Rna をバインドします。我々 は、PKR RNA 複合体を修正し、免疫沈降で分離するホルムアルデヒドの効率的な架橋アクティビティを利用します。PKR co 沈澱 Rna は、高スループット シーケンス ライブラリを生成するさらに処理することができます。PKR と相互作用する細胞二本鎖 rna の 1 つの主要なクラスは、重鎖と光鎖 Rna の相補的な相互作用による分子鎖 Rna として存在できますミトコンドリア Rna (mtRNAs) です。これらの二重 mtRNAs の strandedness を勉強するには、本鎖固有 qRT PCR のためのプロトコル。私達のプロトコルは PKR バインド Rna の解析に最適化されますが、細胞二本や他の dsRNA の結合蛋白質の RNA インターアクターを研究する簡単に変更できます。
Introduction
プロテインキナーゼ rna (PKR)、として知られている真核生物の開始因子 2 α キナーゼ 2 (EIF2AK2) はよ特徴付けられた蛋白質キナーゼ Rna によって提供される情報を伝送します。それは真核生物の翻訳開始 2 サブユニット α (神経: Eif2) に属するキナーゼ家族とグローバル翻訳1を抑制して感染への応答でセリン 51 で神経: Eif2 を廃止します。このコンテキスト PKR は PKR 活性化と自己リン酸化2のプラットフォームを提供するウイルスの二本鎖 Rna (二本) によってアクティブ化されます。神経: Eif2、に加えて PKR できますもをリン酸化 p53、インスリン受容体基質 1、阻害剤 B、c 6 月 N 末端キナーゼ (JNK) 多数信号伝達経路3,4、5の活動を規制するには 6。
PKR はもともとポリオ ウイルスの伝染の間にポリオ ウイルスの二本7、8を認識することによって神経: Eif2 をリン酸化するキナーゼとして同定されました。PKR は昨今は免疫応答を超えて多面的な役割を果たすことと多くの人間の病気でその異常活性化や故障はございません。アクティブ/Phosphorylated PKR (pPKR) はアポトーシス中によく見られる、変性疾患、特にハンチントン病などの神経変性疾患、パーキンソンのおよびアルツハイマー病9 患者の共通の特徴 ,,1011,12,13。また、PKR は代謝ストレスや熱衝撃14,15,16,17など様々 なストレス条件下で作動します。その一方で、PKR 阻害は高められた細胞増殖とも悪性転化18,19の結果します。PKR 関数はまた正常な脳機能に重要なと pPKR のレベルとして細胞周期の間に高架 M 相20,21,22時。このコンテキストで pPKR はグローバルな翻訳を抑制する適切な細胞分裂20に必要なキーの分裂シグナル伝達システムへの手がかりを提供しています。また、pkr からの持続性の活性化は中国のハムスターの卵巣の細胞周期の停止細胞23G2/m 期で起因しました。その結果、PKR のリン酸化は、21M/G1 遷移中に急速な不活性化を確保するため負帰還ループによって調整されます。
PKR の広い範囲の機能にもかかわらず PKR 活性化の私達の理解は、キャプチャし、PKR をアクティブにすることができます二本を識別する標準化されたハイスループット実験的アプローチの不足のため制限されています。前の研究は、PKR を二本 2 倒立 Alu 反復 (IRAlus)20,24が、細胞周期の間にまたはの下で PKR をアクティブにすることができます追加の細胞二本鎖 rna の存在の可能性によって形成されるやり取りできること示されています。ひと細胞におけるストレス条件は探検でした。RNA 結合タンパク質 (RBP) の RNA インターアクターを識別するに従来のアプローチは、クロスリンク RNA RBP 錯体25,26,27に紫外光を使用します。最近の研究はマウス システムのこの UV 架橋アプローチを適用し、核小体低分子 Rna が代謝ストレス16の間に PKR 活性化を調節することが識別されます。ホルムアルデヒドの高架橋効率を活用することにより28HeLa 細胞の細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を識別する方法を提案します。同様のアプローチは、シュタウフェン Drosha29,30,31など他の dsRBPs を研究に適用されています。短い散在させていて核要素 (正弦波)、長い散在核要素 (ライン)、内在性レトロ ウイルス要素 (ERV) とも α サテライト Rna など PKR が非翻訳 Rna のさまざまな種類と対話できるとわかった。また、PKR がミトコンドリア Rna (mtRNAs)、重鎖と光の相補的な相互作用を介してどのフォームの分子間二本鎖 Rna28と対話できることを示した。最近の出版物は、さらにいくつかの mtRNAs が二重のフォームに存在し、dsRNA センサー32インターフェロンを誘発する分化関連タンパク質悪性黒色腫 5 などをアクティブにすることができます私たちのデータをサポートしました。もっと重要なは、表現と mtRNAs の細胞内局変調細胞周期の間に、様々 なストレスによって28PKR 活性化を調節する能力に重要な可能性があります。
この記事で提案する架橋結合する最近開発されたホルムアルデヒドと免役沈降法 (fCLIP) のための詳しいプロトコルを取り込み、細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を解析するメソッド。チミジンとノコダゾールを用いた細胞周期停止試料を準備する方法を示す.これらの Rna を識別する高スループット シーケンス ライブラリを準備する PKR バインド Rna とメソッドを特定する fCLIP プロセスを提案する.さらに、我々 は qRT PCR を使用して PKR バインド Rna を分析する手順の詳細を描きます。具体的には、mtRNAs の strandedness を分析するアンチセンス逆転写法を紹介します。記述されていたプロトコルは HeLa 細胞の PKR、最適化されますが、細胞周期サンプル、fCLIP、アンチセンス qRT PCR 解析の準備などの重要なステップは、携帯電話の二本を勉強するまたは他の dsRBPs の RNA インターアクターを識別するために簡単に変更できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
S または M 相逮捕のサンプルを準備するプロセスを図 1に示します。S 期の細胞を逮捕、逮捕高効率 (図 1 a) を確保する間に 9 h のリリースで 2 回チミジンと細胞を扱ってチミジンの二重ブロック メソッドを使用しました。チミジンと一度セルを扱って M 相の逮捕のため 9 h のリリースに続いて、ブロック prometaphase (図 1 b) 細胞…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 韓国政府科学省と ICT (NRF 2016R1C1B2009886) によって資金を供給によって支えられました。
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
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