تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت
Summary
نحن وصف طريقه لبناء الاجهزه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والهيكل العضوي متعدد الخلية. يسمح هذا الجهاز بتحليل الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان في البيئات المجهرية ثلاثية الابعاد مع تدرجات تشيمواتراكتانت محدده. Organoids هي أفضل من خلايا واحده في الكشف عن المدخلات الضعيفة الصاخبة.
Abstract
وقد أثارت القيود المختلفة لنظم الثقافة الخلية 2D الاهتمام في ثقافة الخلية 3D ومنصات التحليل ، والتي من شانها ان تحاكي بشكل أفضل التعقيد المكاني والكيميائي للانسجه الحية وتقليد في وظائف الانسجه المجرية. وقد يسرت التطورات الاخيره في تكنولوجيات التصنيع المجهري تطوير بيئات ثلاثية الابعاد في المختبر يمكن فيها دمج الخلايا في مصفوفة واضحة المعالم خارج الخلية (ECM) ومجموعه محدده من الجزيئات البيولوجية المرتبطة القابلة للذوبان أو المصفوفة. غير ان الحواجز التكنولوجية قد حدت من استخدامها علي نطاق واسع في مختبرات البحوث. هنا ، ونحن وصف طريقه لبناء أجهزه بسيطه للثقافة 3D والتجريب مع الخلايا والعضوية المتعددة الخلية في البيئات المجهرية 3D مع التدرج تشيمواتراكتانت محدده. ونحن نوضح استخدام هذه المنصة لتحليل استجابه الخلايا الظهاريه والعضوية العضوية لتدرجات عوامل النمو ، مثل عامل نمو البشرة (EGF). وكانت التدرجات EGF مستقره في الاجهزه لعده أيام مما ادي إلى تشكيل فرع الموجهة في الثدي العضوي. وقد سمح لنا هذا التحليل بالخلوص إلى ان استشعار التدرج الجماعي من قبل مجموعات من الخلايا أكثر حساسية مقارنه بالخلايا المفردة. ونحن أيضا وصف طريقه التصنيع ، والتي لا تتطلب مرافق التصوير الضوئي ولا تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة المتقدمة. سيكون هذا الأسلوب مفيدا لدراسة السلوكيات الخلوية ثلاثية الابعاد في سياق تحليل التطور والحالات المرضية ، بما في ذلك السرطان.
Introduction
في البيئة الفسيولوجية ، يتم تضمين الخلايا في مصفوفة خارج الخلية (ECM) وتتعرض لكثرة من الجزيئات الحيوية. التفاعلات بين الخلايا والبيئة المجهرية المحيطة تنظم العمليات داخل الخلايا السيطرة علي الأنماط الظاهرية المتنوعة ، بما في ذلك الهجرة والنمو والتمايز والبقاء علي قيد الحياة1،2. وقد تعلمت الكثير عن السلوكيات الخلوية في ثقافة خليه ثنائيه الابعاد التقليدية. ومع ذلك ، مع ظهور التصوير الانترافيتال والتجريب مع الخلايا المضمنة في الهلام المائي ثلاثي الابعاد ، تم التعرف علي الاختلافات الهامه في سلوكيات الخلايا في الثقافات المبسطة ثنائيه الابعاد في المختبر مقابل بيئات تشبه الانسجه ثلاثية الابعاد. بينما تتفاعل الخلايا مع ألياف ECM وتستشعر خواصها الميكانيكية داخل المصفوفة ثلاثية الابعاد ، فان الصلابة المادية للجل ليست متغيرا مستقلا تماما في نظام ثنائي الابعاد في المختبر. الابعاد يغير تشكيل التصاق البؤري ، مما يؤدي إلى شكل الخلية المختلفة والسلوك. وعلاوة علي ذلك ، تتعرض الخلايا علي سطح ثنائي الابعاد لإشارات اقل من الخلايا المفتوحة لجميع الاتجاات في الابعاد الثلاثية.
وقد زادت هذه القيود من الاهتمام بالانظمه ثلاثية الابعاد التي تمثل التعقيد المكاني والكيميائي للانسجه الحية والتنبؤ بشكل أفضل بوظائف الانسجه المجرية. وقد وضعت في اشكال كثيره من organoids كما الذاتي تجميع الهياكل الخلوية إلى خلايا تتخللها عشوائيا في ECM3,4. وقد يسرت التطورات الاخيره في تكنولوجيات التصنيع المجهري ظهور أنواع مختلفه من نظم الثقافة ثلاثية الابعاد5، 6،7،8،9 لدراسة التغيرات الظاهرية الاستجابات الخلوية للإشارات القابلة للذوبان; بيد ان الحواجز التكنولوجية تحد من الاستخدام الواسع النطاق في مختبرات البحوث. في كثير من الحالات ، تتطلب عمليات التصنيع تقنيات التصوير الضوئي والمعارف الخلفية للطباعة الحجرية الناعمة. وعلاوة علي ذلك ، يجب السيطرة علي عوامل مختلفه لبناء جهاز بنجاح وتحقيق وظيفة الأمثل للجهاز علي مدي فتره طويلة من الزمن.
طريقتنا يصف كيفيه بناء جهاز PDMS 3D لدمج الخلايا والعضوية المتعددة الخلية في البيئة المجهرية 3D مع التدرجات تشيمواتراكتانت المحددة ومن ثم تحليل الاستجابات الظهاريه إلى EGF10. بياناتنا تكشف عن ان قدره organoids للرد علي التدرجات EGF الضحلة تنشا من اقتران الكيميائية بين الخلايا من خلال تقاطعات الفجوة. وهو يوحي بقدره العضو العضوي علي الكشف بدقه أكبر عن المدخلات الضعيفة والصاخبة المصنفة مكانيا. عمليه التصنيع لا تتطلب مرفق غرفه الأبحاث ولا تقنيات التصوير الضوئي. ومع ذلك ، فان جهاز PDMS ثلاثي الابعاد يتضمن العوامل الضرورية للبيئة الفسيولوجية ثلاثية الابعاد. هذه الطريقة ستكون مفيده لدراسة السلوكيات الخلوية ثلاثية الابعاد ولديها إمكانات بحثيه كبيره مع أنواع مختلفه من الخلايا ، تشيمواتراكتانتس ، وتركيبات ECM.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم اجراء تصنيع قوالب PDMS باستخدام خدمه الطباعة 3D التجارية ، ولكن يمكن أيضا ان يتحقق من قبل الطابعة 3D نهاية عاليه في المنزل. من بين مختلف أساليب التصنيع ثلاثي الابعاد ، ينصح بالتصوير المجسم لتوليد العفن عالي الدقة. لان معالجه PDMS يحدث في درجه حرارة عاليه (80 درجه مئوية) ، يجب ان تكون المواد مقاو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بالمنح المقدمة إلى الجمعية الخيرية (NSF PD-11-7246 ، ومؤسسه بحوث سرطان الثدي (BCRF) ، والU54 CA210173) وال (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
