Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi
Summary
Biz 3D kültür ve hücreler ve çok hücreli organoids ile deney için cihazlar oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu cihaz, tanımlanan kemoçekici degradeler ile 3D mikro ortamlarda çözünür sinyallere hücresel tepkiler analizi sağlar. Organoids zayıf gürültülü girişleri tespiti tek hücrelerden daha iyidir.
Abstract
2D hücre kültürü sistemlerinin çeşitli sınırlamaları, canlı dokuların uzamsal ve kimyasal karmaşıklığını daha iyi taklit eden ve in vivo doku fonksiyonlarını taklit etmek üzere 3D hücre kültürü ve analiz platformlarına ilgi uyandırdı. Mikrofabrikasyon teknolojilerinde son gelişmeler, hücrelerin iyi tanımlanmış bir ekstrasellüler matrisin (ECM) ve tanımlanan çözünür veya matris ilişkili biomolecules setine entegre edilebilir 3D in vitro ortamlarda gelişimini kolaylaştırmış. Ancak teknolojik engelleri araştırma laboratuvarlarında yaygın kullanımı sınırlıdır. Burada, 3 boyutlu kültür ve hücre ile deney için basit cihazlar oluşturmak için bir yöntem tarif ve 3D mikro ortamlarda çok hücreli organoids tanımlı bir kemoçekici gradyan ile. Biz bu platformun epitelyal hücrelerin ve organoidlerin epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörlerinin degradelere tepkisini analiz etmek için kullanımını göstermektedir. EGF degradeler, meme organoidlerde yönlendirilmiş şube oluşumuna yol açan birkaç gün boyunca cihazlarda istikrarlı oldu. Bu analiz bize hücre grupları tarafından toplu degrade algılama daha hassas vs tek hücreler sonucuna izin verdi. Ayrıca fotolitografi tesisleri veya gelişmiş yumuşak litografi teknikleri gerektirmeyen imalat yöntemini de tarif ediyoruz. Bu yöntem, kanser dahil olmak üzere kalkınma ve patolojik devletlerin Analizi bağlamında 3D hücresel davranışları incelemek için yararlı olacaktır.
Introduction
Fizyolojik ortamda, hücreler, bir ekstrüle matrisine (ECM) gömülür ve bir bolluk biomolecules maruz kalır. Hücreler ve çevredeki mikroçevre arasındaki etkileşimler, göç, büyüme, farklılaşma ve hayatta kalma dahil olmak üzere farklı phenotypes kontrol hücre içi süreçleri düzenleyen1,2. Konvansiyonel 2D hücre kültüründe hücresel davranışlar hakkında çok şey öğrenildi. Ancak, 3D Hidrojeller gömülü hücreler ile intravital görüntüleme ve deneme gelişiyle, hücre davranışları önemli farklar Basitleştirilmiş 2D in vitro kültürler vs 3D doku benzeri ortamlar tanınmıştır. Hücreler ECM lifleri ile etkileşime girirken ve 3D matriks içindeki mekanik özelliklerini hissederken, jelin malzeme sertliği 2D in vitro sistemde tam bağımsız bir değişken değildir. Ölçümlendirme, fokal yapışma oluşumunu değiştirir, farklı hücre morfolojisi ve davranışları ile sonuçlanır. Ayrıca, 2B yüzeydeki hücreler, 3B ‘de tüm yönlere açık olan hücrelerden daha az sinyal verme ipuçları ortaya çıkar.
Bu sınırlamalar, yaşam dokularının uzamsal ve kimyasal karmaşıklığı temsil eden ve daha iyi in vivo doku fonksiyonları tahmin 3D sistemlerin çıkarlarını artmıştır. Bunlar, ECM3,4‘ te rasgele serpiştirilmiş hücrelere Self-montajı hücresel mikroyapıları olarak organoids birçok formda geliştirilmiştir. Microimalat teknolojileri son gelişmeler 3D kültür sistemleri5,6, 7,8,9 çeşitli türleri gelişlerini kolaylaştırmış fenotipik değişiklikler ve incelemek için çözünür sinyallere hücresel tepkiler; Ancak teknolojik bariyerler araştırma laboratuvarlarında yaygın kullanımı sınırlandırmaktadır. Birçok durumda, imalat süreçleri fotolitografi teknikleri ve yumuşak litografi için arka plan bilgiler gerektirir. Dahası, bir cihaz inşa etmek ve uzun bir süre boyunca cihazın optimum fonksiyonunu elde etmek için çeşitli faktörler kontrol edilmelidir.
Yöntemimiz, hücreleri ve çok hücreli organoidleri tanımlanan kemoçekici degradelerle 3B mikro ortama birleştirmek ve ardından EGF10‘ a epitelyal yanıtları analiz etmek IÇIN 3B PDMS cihazının nasıl oluşturulacağını açıklar. Verilerimiz, yüzeysel EGF degradelere yanıt vermek için organoidlerin kapasitesinin, hücre içi kimyasal bağlamanın Gap kavşakla ortaya çıkması anlamına gelmiştir. Zayıf ve gürültülü uzamsal olarak dereceli girişlerin daha kesin tespiti için organoidlerin potansiyelini göstermektedir. İmalat süreci temiz oda tesisi veya fotolitografi teknikleri gerektirmez. Ancak, 3D PDMS cihaz 3D fizyolojik çevre gerekli faktörleri içerir. Bu yöntem 3D hücresel davranışlarını incelemek için yararlı olacaktır ve farklı hücre tipleri, kemoçekiciler ve ECM kombinasyonları ile büyük bir araştırma potansiyeline sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS kalıpları imalat ticari bir 3D baskı hizmeti kullanılarak yapılmıştır, ama aynı zamanda yüksek uç 3D yazıcı-ev tarafından gerçekleştirilebilir. Çeşitli 3D imalat yöntemleri arasında, stereolitografi yüksek çözünürlüklü kalıp üretimi için tavsiye edilir. PDMS kür yüksek sıcaklıkta oluştukları için (80 °C), malzemelerin yeterli sıcaklığa dayanıklı olması, hangi açıkça belirtilmelidir, baskı dış kaynaklı ise. Bir termal Post-Cure parçanın termal direnci artırmak iç…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, AJE ‘ye hibe (NSF PD-11-7246, meme kanseri Araştırma Vakfı (BCRF-17-048) ve NCı U54 CA210173) ve AL (U54CA209992) tarafından destekleniyordu.
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
