趋化梯度多细胞响应的三维分析
Summary
我们描述了一种方法来构建设备的三维培养和实验与细胞和多细胞有机体。该装置允许分析在具有明确趋化因子梯度的三维微环境中对可溶性信号的细胞反应。在检测弱噪声输入时, 有机体优于单个细胞。
Abstract
2D 细胞培养系统的各种局限性引发了人们对三维细胞培养和分析平台的兴趣, 这些平台将更好地模拟活组织的空间和化学复杂性, 并模拟体内组织功能。最近在微细加工技术的发展促进了三维在体外环境中的发展, 在这种环境中, 细胞可以被整合到一个明确的细胞外基质 (ECM) 和一组定义的可溶性或基质相关的生物分子。然而, 技术障碍限制了其在研究实验室的广泛使用。在这里, 我们描述了一种方法, 以构建简单的设备, 用于三维培养和实验的细胞和多细胞有机体在三维微环境中具有明确的趋化因子梯度。我们说明了使用这个平台来分析上皮细胞和有机体对生长因子梯度的反应, 如表皮生长因子 (EGF)。EGF 梯度在设备中稳定了几天, 导致乳腺有机体中的定向分支形成。这一分析使我们能够得出结论, 细胞组的集体梯度检测对单个细胞更为敏感。我们还描述了制造方法, 它不需要光刻设施, 也不需要先进的软光刻技术。该方法将有助于研究三维细胞行为的背景下, 分析发展和病理状态, 包括癌症。
Introduction
在生理环境中, 细胞被嵌入细胞外基质 (ECM) 中, 并暴露在大量的生物分子中。细胞与周围微环境之间的相互作用调节控制多种表型的细胞内过程, 包括迁移、生长、分化和存活1,2。在传统的2D 细胞培养中, 人们已经对细胞行为有了很多了解。然而, 随着血管内成像和3D 水凝胶中嵌入细胞实验的出现, 在简化的二维体外培养物与三维组织样环境中已经认识到细胞行为的重要差异。当细胞与 ECM 纤维相互作用并在三维矩阵中感知其机械性能时, 凝胶的材料刚度在2D 体外系统中并不是一个完全独立的变量。尺寸改变了焦点粘附的形成, 导致细胞形态和行为不同。此外, 与在3D 中打开向所有方向开放的细胞相比, 2D 表面上的细胞接触到的信号线索更少。
这些限制增加了对代表活组织的空间和化学复杂性的三维系统的兴趣, 并更好地预测体内组织功能。它们以多种形式发育, 从自组装细胞微结构到随机穿插在 ecm3,4中的细胞。最近在微细加工技术方面的进展促进了各种类型的3d 培养系统5、6、7、8、9的出现 , 用于研究表型变化和细胞对可溶性信号的反应;然而, 技术障碍限制了研究实验室的广泛使用。在许多情况下, 制造过程需要光刻技术和软光刻的背景知识。此外, 必须控制各种因素, 才能成功构建设备, 并在很长一段时间内实现设备的最佳功能。
我们的方法描述了如何构建一个 3D PDMS 设备, 将细胞和多细胞有机体整合到具有明确趋化因子梯度的三维微环境中, 然后分析上皮对 EGF10的反应。我们的数据表明, 有机生物对浅 EGF 梯度的反应能力来自于通过缝隙连接的细胞间化学耦合。这表明有机生物在更精确地检测弱和嘈杂的空间梯度输入方面具有潜力。制造过程不需要洁净室设施, 也不需要光刻技术。然而, 3D PDMS 设备包含了3D 生理环境的必要因素。该方法将有助于研究三维细胞行为, 具有较大的研究潜力, 不同的细胞类型, 趋化因子和 ECM 组合。
Protocol
Representative Results
Discussion
PDMS 模具的制造是使用商业3D 打印服务进行的, 但也可以通过内部高端3D 打印机来完成。在各种3D 制造方法中, 建议采用立体平版印刷来生成高分辨率模具。由于 PDMS 固化是在高温 (80°c) 下进行的, 因此如果将打印外包, 材料应具有足够的耐热性, 应明确指定。可以与印刷服务公司讨论热后固化问题, 以提高零件的耐热性。印刷服务和材料的细节在材料表中规定。
固?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了向 AJE (NSF PD-11-7246、乳腺癌研究基金会 (BCRF-17-048) 和 NCI U54 CA210173) 和 AL (U54CA209992) 的赠款的支持。
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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