3D-analyse van multi-cellulaire reacties op chemoattractant gradiënten
Summary
We beschrijven een methode om apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids. Dit apparaat maakt analyse van cellulaire reacties op oplosbare signalen in 3D-micromilieus met gedefinieerde chemoattractant gradiënten. Organoids zijn beter dan enkele cellen bij de opsporing van zwakke luidruchtige ingangen.
Abstract
Verschillende beperkingen van de 2D-cel cultuursystemen hebben gevonkt interesse in 3D-cel cultuur en analyse platforms, die beter zou nabootsen van de ruimtelijke en chemische complexiteit van levende weefsels en na te bootsen in vivo weefsel functies. Recente ontwikkelingen in de microfabricage technologieën hebben de ontwikkeling van 3D in vitro omgevingen vergemakkelijkt waarin cellen kunnen worden geïntegreerd in een goed gedefinieerde extracellulaire matrix (ECM) en een gedefinieerde set van oplosbare of matrix geassocieerde biomoleculen. De technologische belemmeringen hebben echter hun wijdverbreide gebruik in onderzoekslaboratoria beperkt. Hier beschrijven we een methode om eenvoudige apparaten te construeren voor 3D-cultuur en experimenten met cellen en multicellulaire organoids in 3D-micromilieus met een gedefinieerde chemoattractant gradiënt. Wij illustreren het gebruik van dit platform voor de analyse van de respons van epitheelcellen en organoids naar gradiënten van groeifactoren, zoals epidermale groeifactor (EFG). EFG gradiënten waren stabiel in de apparaten voor enkele dagen die leiden tot gerichte Branch vorming in de borst organoids. Deze analyse konden we concluderen dat collectieve gradiënt sensing door groepen van cellen is gevoeliger versus enkele cellen. We beschrijven ook de fabricagemethode, die niet nodig fotolitho grafie faciliteiten, noch geavanceerde zachte lithografie technieken. Deze methode zal nuttig zijn om 3D cellulair gedrag te bestuderen in de context van de analyse van de ontwikkeling en pathologische staten, met inbegrip van kanker.
Introduction
In fysiologische omgeving, cellen zijn ingebed in een extracellulaire matrix (ECM) en blootgesteld aan een overvloed aan biomoleculen. Interacties tussen cellen en de omliggende omgeving reguleren intracellulaire processen die diverse fenotypes beheersen, waaronder migratie, groei, differentiatie en overleving1,2. Er is veel geleerd over cellulair gedrag in een conventionele 2D-cel cultuur. Echter, met de komst van intravital Imaging en experimenten met cellen ingebed in 3D-hydrogels, belangrijke verschillen in cel gedrag zijn erkend in de vereenvoudigde 2D in vitro culturen versus 3D-weefsel-achtige omgevingen. Terwijl de cellen interageren met ECM vezels en de betekenis van hun mechanische eigenschappen binnen de 3D-matrix, de materiële stijfheid van de gel is niet een volledig onafhankelijke variabele in een 2D in vitro-systeem. De dimensionaliteit verandert focal adhesie vorming, wat resulteert in verschillende cel morfologie en gedrag. Bovendien zijn cellen op een 2D-oppervlak blootgesteld aan minder signalering cues dan cellen open voor alle richtingen in 3D.
Deze beperkingen hebben de belangen verhoogd voor 3D-systemen die de ruimtelijke en chemische complexiteit van levende weefsels vertegenwoordigen en beter voorspellen in vivo weefsel functies. Zij zijn ontwikkeld in vele vormen van organoids als zelf-assembleert cellulaire microstructuren aan cellen die willekeurig in ECM worden gestrooid3,4. Recente ontwikkelingen in de microfabricage technologieën hebben de komst van verschillende soorten 3D-cultuursystemen5,6,7,8,9 voor het bestuderen van fenotypische veranderingen en cellulaire reacties op oplosbare signalen; technologische belemmeringen beperken echter het wijdverbreide gebruik in onderzoekslaboratoria. In veel gevallen, de fabricageprocessen vereisen fotolitho grafie technieken en achtergrondkennis voor zachte lithografie. Bovendien moeten verschillende factoren worden gecontroleerd om met succes een apparaat te bouwen en om een optimale functie van het apparaat te bereiken over een lange periode van tijd.
Onze methode beschrijft hoe een 3D PDMS apparaat te construeren voor de integratie van cellen en multicellulaire organoids in een 3D-omgeving met gedefinieerde chemoattractant gradiënten en vervolgens te analyseren epitheel reacties op EFG10. Uit onze gegevens blijkt dat de capaciteit van organoids om te reageren op ondiepe EFG-gradiënten voortvloeit uit intercellulaire chemische koppeling door gap junctions. Het suggereert het potentieel van organoids voor een nauwkeurigere opsporing van zwakke en lawaaierige ruimtelijk gegradeerde ingangen. Het fabricageproces vereist geen cleanroom installatie, noch fotolitho grafie technieken. Echter, de 3D PDMS apparaat bevat de nodige factoren van 3D fysiologische omgeving. Deze methode zal nuttig zijn om 3D cellulair gedrag te bestuderen en het heeft groot onderzoekpotentieel met verschillende cel types, chemoattractants, en ECM combinaties.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fabricage van PDMS mallen werd uitgevoerd met behulp van een commerciële 3D print service, maar kan ook worden bereikt door een high-end 3D-printer in-House. Onder verschillende 3D fabricagemethoden, stereolithography wordt aanbevolen voor hoge resolutie schimmel generatie. Omdat PDMS uitharding op hoge temperatuur (80 °C) plaatsvindt, moeten de materialen voldoende thermisch resistent zijn, die expliciet moeten worden gespecificeerd, als het afdrukken uitbesteed is. Een thermische post-Cure kan worden besproken met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door toelagen aan AJE (NSF PD-11-7246, de Stichting van het onderzoek van de borstkanker (BCRF-17-048), en NCI U54 CA210173) en AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
