3D анализ Мультиклеточных реакций на Хемоаттрактантные градиенты
Summary
Мы описываем метод для построения устройств для 3D-культуры и экспериментов с клетками и многоклеточных органоидов. Это устройство позволяет анализировать клеточные реакции на растворимые сигналы в 3D микросредах с определенными хемоаттрактантом градиентами. Органоиды лучше, чем одиночные клетки при обнаружении слабых шумных входов.
Abstract
Различные ограничения систем 2D клеток культуры вызвали интерес к 3D клеток культуры и анализа платформ, которые лучше имитируют пространственную и химическую сложность живых тканей и имитировать в естественных условиях ткани функций. Недавние достижения в области технологий микропроизводства способствовали развитию 3D-среды в пробирке, в которой клетки могут быть интегрированы в четко определенную внеклеточной матрице (ЕСМ) и определенный набор растворимых или матричных связанных биомолекул. Однако технологические барьеры ограничивают их широкое применение в исследовательских лабораториях. Здесь мы описываем метод построения простых устройств для 3D-культуры и экспериментирования с клетками и многоклеточных органоидов в 3D микросредах с определенным градиентом хемоаттрактанта. Мы проиллюстрируем использование этой платформы для анализа реакции эпителиальных клеток и органоидов на градиенты факторов роста, таких как фактор эпидермального роста (EGF). Градиенты EGF были стабильными в устройствах в течение нескольких дней, что привело к созданию направленной ветви в органоиды молочной железы. Этот анализ позволил нам заключить, что коллективный градиент зондирования группами ячеек более чувствителен против одиночных ячеек. Мы также описываем метод изготовления, который не требует фотолитографии объектов, ни передовые методы мягкой литографии. Этот метод будет полезен для изучения 3D сотовой поведения в контексте анализа развития и патологических состояний, включая рак.
Introduction
В физиологических условиях, клетки встроены в внеклеточной матрицы (ЕСГ) и подвергается множество биомолекул. Взаимодействия между клетками и окружающей микросредой регулируют внутриклеточные процессы, контролирующие различные фенотипы, включая миграцию, рост, дифференциацию и выживание1,2. Многое было изучено о клеточных поведениях в обычной культуре 2D клеток. Однако, с появлением внутриклеточной визуализации и экспериментов с клетками, встроенными в 3D-гидрогели, важные различия в поведении клеток были признаны в упрощенном 2D в пробирке культур против 3D-ткани, как сред. В то время как клетки взаимодействуют с ПОМЕХОГЕНЕРАТОРАМИ и чувствуют их механические свойства в 3D матрице, жесткость материала геля не является полностью независимой переменной в системе 2D в пробирке. Размерность изменяет формирование фокусной адгезии, что приводит к разной морфологии клеток и поведению. Кроме того, ячейки на 2D поверхности подвержены меньшему сигналу сигнализации, чем ячейки, открытые для всех направлений в 3D.
Эти ограничения увеличили интересы для 3D-систем, которые представляют пространственную и химическую сложность живых тканей и лучше предсказать в естественных условиях ткани функции. Они были разработаны во многих формах от органоидов как самостоятельной сборки клеточных микроструктур для клеток случайным чередовались в ЕСГ3,4. Недавние достижения в области технологий микропроизводства способствовали появлению различных типов систем 3D-культуры5,6,7,8,9 для изучения фенотипических изменений и Сотовые ответы на растворимые сигналы; Однако технологические барьеры ограничивают широкое применение в исследовательских лабораториях. Во многих случаях процессы изготовления требуют методов фотолитографии и фоновых знаний для мягкой литографии. Кроме того, необходимо контролировать различные факторы, чтобы успешно построить устройство и достичь оптимальной функции устройства в течение длительного периода времени.
Наш метод описывает, как построить 3D PDF-устройство для включения клеток и многоклеточных органоидов в трехмерную микросреду с определенными градиентами хемоаттрактанта, а затем проанализировать эпителиальные реакции на EGF10. Наши данные свидетельствуют о том, что способность органоидов реагировать на мелкие градиенты EGF обусловлена межклеточной химической связью через узлы разрыва. В нем предлагается потенциал органоидов для более точного выявления слабых и шумных, территориально дифференцированных входов. Процесс изготовления не требует чистых помещений или техники фотолитографии. Тем не менее, 3D PDF устройство включает в себя необходимые факторы 3D-физиологической среды. Этот метод будет полезен для изучения 3D сотовой поведения и имеет большой исследовательский потенциал с различными типами клеток, хемоаттрактанты, и ЕСМ комбинаций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Изготовление форм PDF-формы было выполнено с использованием коммерческой 3D-печати, но также может быть выполнена на высоком конце 3D принтера в доме. Среди различных 3D методы изготовления, стереолитографии рекомендуется для высокого разрешения поколения плесени. Поскольку лечение ипрс ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами АДС (НДП-11-7246, Фонд исследований рака молочной железы (БОФД-17-048) и НИР U54 CA210173) и AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
