ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט
Summary
אנו מתארים שיטה לבניית התקנים לתרבות תלת-ממדית ולניסויים בתאים ובאורגנואידים רב-תאיים. התקן זה מאפשר ניתוח של תגובות הסלולר אותות מסיסים בסביבות תלת-ממד עם מעברי צבע כימותסטנט מוגדרים. אורגנואידים הם טובים יותר מאשר תאים בודדים בזיהוי של כניסות רעש חלש.
Abstract
מגבלות שונות של 2D מערכות תרבות תא יש התעניינות בתרבות תא תלת-ממד ופלטפורמות ניתוח, אשר יהיה טוב יותר לחקות את המורכבות המרחבית והכימית של רקמות החיים ולחקות בפונקציות רקמה vivo. ההתפתחויות האחרונות בטכנולוגיות microfabrication הקלו את ההתפתחות של 3D בסביבות מבחנה שבהם תאים ניתן לשלב לתוך מטריצה החילוץ מוגדר היטב (ECM) וערכה מוגדרת של מסיסים או מטריצה הקשורים. עם זאת, מחסומים טכנולוגיים הוגבלה שימוש נרחב במעבדות מחקר. כאן, אנו מתארים שיטה לבנות מכשירים פשוטים לתרבות תלת-ממדית וניסויים עם תאים ואורגנואידים רב-תאיים בסביבות תלת-ממד עם מעבר צבע כימוסטנט מוגדר. אנו ממחישים את השימוש בפלטפורמה זו לניתוח התגובה של תאים אפיתל ואורגנואידים למעברי צבע של גורמי גדילה, כגון גורם גידול באפידרמיס (EGF). מעברי הצבע EGF היו יציבים במכשירים במשך מספר ימים המובילים להקמת ענף בבימוי אורגנואידים השד. ניתוח זה איפשר לנו להסיק שמעבר הצבע הקולקטיבי הרגיש לפי קבוצות תאים רגיש יותר לעומת תאים בודדים. כמו כן, אנו מתארים את שיטת הייצור, אשר אינה דורשת מתקני פוטוגרפיה ולא טכניקות ליתוגרפיה רכות מתקדמות. שיטה זו תהיה מועילה לחקר התנהגויות סלולריות תלת-ממדית בהקשר של ניתוח התפתחות ומצבים פתולוגיים, כולל סרטן.
Introduction
בסביבה הפיסיולוגית, התאים מוטבעים במטריצה מועלת (ECM) ונחשפת למגוון רחב של biomolecules. אינטראקציות בין תאים לבין מיקרואקולוגיה סביב ויסות תהליכים תאיים השליטה בפנוטיפים מגוונים, כולל הגירה, צמיחה, בידול והישרדות1,2. הרבה למדו על התנהגויות סלולריות בתרבות התא 2D קונבנציונאלי. עם זאת, עם הופעתו של הדמיה וניסויים עם תאים המוטבעים בתוך 3D הידרוג’לים, הבדלים חשובים התנהגויות תא זוהו ב-2D פשוטה בתרבויות מבחנה לעומת 3D רקמות כמו בסביבות. בעוד תאים אינטראקציה עם סיבי ECM ולחוש תכונות מכניות שלהם בתוך מטריצה תלת-ממדית, קשיחות החומר של ג’ל אינו משתנה בלתי תלוי לחלוטין ב-2D במערכת מבחנה. הממד משנה מערך הדבקה מוקד, וכתוצאה מכך מורפולוגיה והתנהגות של תאים שונים. יתר על כן, תאים על פני שטח דו-ממדי חשופים ליותר אותות איתות מאשר תאים הפתוחים לכל הכיוונים ב-3D.
מגבלות אלה הגדילו את האינטרסים עבור מערכות 3D המייצגים את המורכבות המרחבית והכימית של רקמות החיים ולנבא טוב יותר בפונקציות vivo רקמה. הם פותחו בצורות רבות של אורגנואידים כמו הרכבה עצמית מיקרו מבנים סלולריים לתאים באופן אקראי ב ecm3,4. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות microfabrication הקלו את הופעתו של סוגים שונים של 3d מערכות תרבות5,6,7,8,9 עבור לימוד שינויים פנוטיפים ו תגובות סלולריות לאותות מסיסים; עם זאת, מחסומים טכנולוגיים מגבילים את השימוש הנרחב במעבדות המחקר. במקרים רבים, תהליכי הייצור דורשים טכניקות ליתוגרפיה ורקע לדפוס רך. יתר על כן, גורמים שונים חייבים להיות נשלט כדי לבנות בהצלחה מכשיר להשיג פונקציה אופטימלית של המכשיר על פני תקופה ארוכה של זמן.
השיטה שלנו מתארת כיצד לבנות התקן 3D PDMS לשילוב תאים ואורגנואידים רב-תאיים לתוך המיקרו מיקרו הסביבה עם מעברי הצבע המוגדרים כימוסטנט ולאחר מכן לנתח את התגובות האפיתל ל-EGF10. הנתונים שלנו חושפים כי הקיבולת של אורגנואידים להגיב על מעברי egf רדוד נובע צימוד כימי התרבות באמצעות צמתים הפער. הוא מציע את הפוטנציאל של אורגנואידים לזיהוי מדויק יותר של קלט מדורגים חלש ורועש מרחב. תהליך הייצור אינו מצריך מתקן חדר נקי ושיטות פוטוגרפיה. עם זאת, המכשיר 3D PDMS כולל את הגורמים הדרושים של הסביבה הפיסיולוגית 3D. שיטה זו תהיה מועילה ללמוד התנהגויות סלולר 3D ויש לו פוטנציאל מחקר גדול עם סוגי תאים שונים, כימומי, ו ECM שילובים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הייצור של תבניות PDMS בוצע באמצעות שירות הדפסה תלת-ממדי מסחרי, אבל יכול להתבצע גם על-ידי מדפסת תלת-ממד באיכות גבוהה בתוך הבית. בין שיטות ייצור תלת-ממד, סטריאואוליתוגרפיה מומלצת ליצירת עובש ברזולוציה גבוהה. מכיוון שריפוי PDMS מתרחש בטמפרטורה גבוהה (80 ° c), החומרים צריכים להיות עמידים בפני חום מספ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים כדי AJE (NSF PD-11-7246, סרטן השד מחקר הקרן (BCRF 17-048), ו NCI U54 CA210173) ו-AL (U54CA209992).
Materials
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
