Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כלים ביתיים פשוטים לטיפול בזבובי פירות-דרוסופילה מלאנוסטר

Published: July 24, 2019 doi: 10.3791/59613
Automatic Translation
1
1Department of Zoology and Animal Physiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University

Summary

המתואר כאן הוא השימוש בכמה כלים תוצרת בית כדי להעביר, לצנן, ולהרוג מבוגרים Drosophila ילה, כמו גם לנקות את התרבות זכוכית מבחנות ולאסוף ביצים. כלים אלה קלים לעשות והם יעילים למדי בטיפול Drosophila ילה.

Abstract

הזבוב הפרי, דרוזופילה מלאנוסטר, משמש רבות גם בחינוך ביולוגי ובביולוגיה. טיפול בזבובים מבוגרים נפוץ אך קשה בפועל, כאשר זבובים מבוגרים עפים. הפגינו כאן היא איך לעשות כמה כלים פשוטים וחסכוניים כדי לטפל בבעיות קשות בטיפול Drosophila ילה. חורים בפקקים מוקצף נעשים ומfunnels ומוכנסים לתוך החורים. לאחר מכן, הזבובים זזים רק בכיוון אחד לתוך מכלול הפיפטה/משפך של הצינורות , ומאפשר שליטה יעילה על העברת הבוגרים לתוך או מתוך בקבוקון. הפרוטוקולים הקיימים שונו לזבובים מצננים על ידי התקררות בקרח כתוש והעברתם אל משטח קר, קשה מסכה. מסכה מכוסה פיסת גזה רפואי שמחזיק ללא קיבוע זבובים מהמים המרוכז כאשר נבדק תחת stereomicroscope. הזבובים מורדמים בסופו של דבר לספירה ולמיון או למחיקה על ידי המיקרוגל. הכלוב בצורת בקבוק פותחה גם עבור איסוף ביצים, כמו גם מכשיר לחסכון בעבודה וליווי פרוטוקול לניקוי בקבוקים של תרבות זכוכית.

Introduction

זבוב הפירות, דרוסופילה מלאנוסטר, הוא אורגניזם מודל המשמש רבות בחינוך ביולוגי ובביולוגיה לחקר מגוון רחב של נושאים1,2. הבעיות הבסיסיות בטיפול בדרוסופילה הן העברת מבוגרים ממבחנה לבקבוקון ולשתק את הזבובים כך שיהיה קל יותר לטפל בהם, כמו כל המבוגרים (למעט מוטציות מסוימות3,4) יכולים לעוף.

מקובל, חוקר מעביר זבובים ממבחנה אחת לאחרת על ידי החזקת שני מבחנות פה-לפה, הקשה על זבובים למטה או לאפשר זבובים לטוס לתוך בקבוקון אחר, ולאחר מכן הפרדת וחיבור מחדש שני מבחנות4. כמובן, הדבר דורש שפתיחת שני מבחנות בקוטר זהה, וקשה לשלוט בכמות הזבובים המועברים. בינתיים, זה דורש ידיים מהירות כדי לבצע את העבודה, ובריחה זבובים תועים יכול לגרום לבעיות עבור המעבדה או הכיתה. הוספת זבובים בתולין נוספים או זבובים זכרים לצלב כבר מוכן היא משימה שגרתית נוספת בניסויים דרוזוהילה . מקובל, זבובים חייב להיות מקיבוע במבחנה לפני תוספת של זבובים נוספים.

מבוגרים מרדימים באופן שגרתי על ידי אתר, CO2, או מצמרר5. לעומת החשיפה לאתר ושיתוף2 , מצמרר הוא הסוכן החסכוני ביותר עבור ששתק למבוגרים דרוסופילה ואת הפחות מזיק הן זבובים וחוקרים (בעיקר סטודנטים צעירים)6,7. עם זאת, מים העבים באופן רציף על פני השטח הקר או מרטיב את הזבובים. קשה לקבוע את פנוטיפים של זבובים רטובים, והם יכולים בקלות להיפגע במהלך מניפולציה8,9. זה שמר על שיטת הצינון. להיות מקובלת יותר

כלים עבור העברת הזבוב ושיטה לקירור מעופף כבר תוארו בעבר10. להלן, מדווחים שטכניקת הרדמה מצמררת ששונתה, הינה בטוחה, אמינה ואפשרית לניסויים בדרוזוהילה . מתואר גם במאמר זה 1) שיטות להרוג מבוגרים עבור ספירה, מיון, או השמטה, 2) התקנים לחסכון בעבודה ופרוטוקולים לניקוי מבחנות של תרבות זכוכית, ו 3) כלוב פשוט לאיסוף ביצים. הכלים תוכנן בקלות וחסכוני המתואר כאן יכול לשמש כדי לטפל בנושאים קשים של טיפול בזבוב, ושיטות אלה נבדקו והוכחו להיות חזקים, אמין, קל לטפל עבור חוקרים מנוסים ומתחילים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת כלים ועזרים

  1. פקקים/משפך
    1. השג שני אטמי ספוג (קוטר התקעים חייב להיות מעט גדול יותר מהקוטר הפנימי של הבקבוקונים המשמשים להעברת זבובים). בצע חור במרכזי של אטמי ספוג עם ברזל מחומם להלחמה חשמלית.
    2. השיגו שני טיפים של הפיפטה, חותכים אחד לחצי בצורה מחוסרת עם סכין חדה, וזורקים את הקצה המחודד. ואז, לחתוך 1.5 ס מ של הקצה המחודד מהקצה השני של הצינורות. הדבק את השרידים של שני הפיפטה ביחד עם דבק לכל מטרה כדי ליצור קצה מוארך של פיפטה (איור 1A).
    3. הכנס משפך ואת הקצה הצינור מוארך לתוך אטמי ספוג כדי ליצור טיפ משפך פקק (להלן המכונה T-ו-F הפקקים) וכיפה את העצה הפיפטה עם צינור מיקרוצנטריפוגה 100 μL (איור 1A).
      הערה: אורך גבעול המשפך חייב להיות גדול מגובה התקע. אם הוא קצר יותר או שווה לגובה של התקע, אז הזבובים יברחו מפתח הגבעול. סוף גבעול המשפך צריך להיות ממוקם לפחות 2 ס מ מעל פני השטח של המדיום התרבותי או התחתון של בקבוקון ריק. Funnels קטנים (למשל, בקוטר הדיסק < 60 מ"מ) עם קטרים קטנים של פתיחת גזע פנימי (< 5 מ"מ) עדיפים. ניתן להשתמש בזכוכית או במשפך פלסטיק כדי ליצור פקק F. עם זאת, funnels פלסטיק עדיפים על שיעורי ביולוגיה, כפי שהם שוברים פחות בקלות מfunnels זכוכית.
  2. מחטים מיקרובתר
    1. השיגו עפרונות מכניים החשים בנוח ביד ובסיכות החרקים התואמים את הקטרים (למשל, 0.5 מ"מ, 0.7 מ"מ) של מילוי העופרת שלהם.
    2. חותכים את הקצוות הרחבים של סיכות החרק עם זוג צבת ולתייק את החלק השטוח. החלף את ההפניה עם הפינים (איור 1B). לחץ על לחצן הלחיצה והזנה של 0.5 – 1 ס מ של סיכה כדי לבצע ניתוח. נקו את הסיכה ודחפו אותו לגמרי חזרה לפיר העיפרון לאחר פעילות הניתוח כדי להפוך אותו לבטוח עבור כל אדם לטפל.
      הערה: מחטים מיקרוספירה שימושיות לא רק בניתוח איברים כגון זחל בלוטות הרוק אלא גם בספירה ומיון זבובים מבוגרים מת.
  3. ליוקס קשוחים
    1. להשיג מספר refreezable icepacks קשה (icepacks בגודל גדול עדיפים). איור 1C מראה icepacks זה עבד היטב, אשר מודד 26.5 ס"מ x 14.5 ס"מ x 2.5 ס"מ יש הצדדים העליון והתחתון כי הם שטוחים לחלוטין.
    2. גזור גזה רפואי (לא סטרילי) לחתיכות כי הם מעט קטנים יותר מאשר המשטחים הקרים של icepacks הם מכסים. לדוגמה, פיסת גזה רפואית מעט קטן יותר מ 26.5 ס"מ x 14.5 ס"מ עדיף לכסות מסכה המוצג באיור 1c.
      הערה: האביזרים הדרושים עבור אלה כלים מצמררת כוללים: תיבת קרח (השתמשנו 25 ס"מ x 15 ס"מ x 15 ס מ תיבת קצף לאדם אחד ו-37 ס"מ x 28 ס"מ x 20 ס מ תיבת עבור יותר מאדם אחד), המשמש לאחסון קרח כתוש; זוג מלקחיים דקים, המשמשים לתפוס זבובים צוננים על ידי כנפיהם ולהעבירם לבקבוקון; זוג כפפות עבודה הגנה, אשר משמשות כדי לקחת מקורר החוצה של a-20 ° c מקפיא; וסרט פלסטיק, המשמש לכיסוי השלב של stereomicroscope.
  4. כלוב איסוף ביצת דרוזוהילה
    הערה: מוכנות מראש אוספים כלובים אוסף ביצים זמינים מחברות ביוטכנולוגיה רבות11. המתואר כאן הוא בקבוק אקרילי קטן בצורת ביצה כלוב איסוף עבור 60 מ"מ מנות פטרי (איור 1D שמאל; עיצוב הכלוב מוצג באמצע). ניתן להתאים אותו למידות אחרות של כלי פטרי (לדוגמה, 100 מ"מ, 35 מ"מ). זה מאפשר העברת זבובים לתוך או מחוץ לכלוב בקלות. כלוב פשוט יכול להיות מוכן כדלקמן.
    1. השתמש בחותך הצמד כדי לגזור בקבוק משקה פלסטי רך (500 mL, קוטר פנימי ca. 65 מ"מ) לתוך 2:1 משוער (קצה מחודד: בקצה קהה) היחס ולמחוק את הקצה הקהה.
    2. עטוף רצועה של נייר כרטיס סביב צלחת מיץ תפוחים (קוטר פנימי 60 מ"מ) עם סרט דביק [צלחת מיץ תפוחים משמש כדי לאסוף ביצים (איור 1E, נכון)].
  5. נהג מברשת שפופרת אלחוטי
    1. השג מנהל מקדחה אלחוטי (מהירות מקסימלית = 500 rpm).
    2. השיגו מברשת שפופרת עם זיפים לאורך הצדדים, כמו גם החזית שלה. באופן אידיאלי, קוטרו של המברשת צריך להיות גדול מעט יותר מקוטר של בבחנות התרבות שיש לנקות. חותכים את קצה הידית שלה כך שניתן להוסיף אותו לתוך המקדחה (איור 1D).
      הערה: האביזרים הדרושים עבור כלי ניקוי אלה כוללים ספוגים מפלדת אל-חלד וכפפות גומי ארוך השרוול.

2. העברת זבובים למבוגרים ממבחנה A כדי בקבוקון B

הערה: העברת זבובים של מבוגרים ממבחנה אחת לאחרת היא הפרקטיקה השכיחה ביותר בניסויים בדרוזוהילה [למשל, העברת זבובים מהתרבות הישנה (א) לתרבות טרייה (b) או מבקבוקון צלב (א) לבקבוקון ריק (ב). הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש עבור כל מבוגר לטוס העברת פעילויות. אלא אם נכתב אחרת, פרוטוקול זה משמש כדי להעביר זבובים ממבחנה A כדי בקבוקון B לאורך הנייר הזה.

  1. בדוק את הגבעול של המשפך של פקק F ואת קצה הפיפטה של פקק T בזהירות, ולאחר מכן נקה את כל הזבובים שנשארו בפקקים עם מפוח אוויר מגומי. שלב זה הוא בעל חשיבות עליונה, במיוחד כאשר מדובר בקבוצה אחת של מטוסי T ו-F המשמשים להעברה רציפה של קווי דרוזוהילה שונים.
  2. להקיש את הזבובים במבחנה A ולהחליף את התקע שלה עם פקק T, ואז לחבר בקבוקון B עם פקק F.
  3. היפוך בקבוקון A מעל בקבוקון B, להכניס את קצה החריץ של הפקק לתוך פתיחת המשפך של מעצור F, להפיל את הקצה של בקבוקון הפוכה A כדי לאפשר זבובים לחמוק מתוך הקצה של הצינורות ודרך גבעול המשפך, וירידה לתוך בקבוקון B. אם כל האוכל הישן במבחנה A הופך פחות קומפקטי, זה עלול לרדת כאשר בקבוקון A הוא הפוך ודפק. במצב כזה, להפוך בקבוקון B מעל בקבוקון A ולאפשר זבובים לזחול לתוך בקבוקון B.
  4. . הפרידו את הפקק מפקק האף המכסה את קצה הפיפטה של מעצור ה-T עם שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 200 μL, אם הזבובים הנותרים במבחנה יש צורך להעביר לבקבוקונים אחרים בכל רגע; אחרת, להסיר את הפקק ולחבר מחדש את המבחנה א. הסר את הפקק F וחבר מחדש בקבוקון B.

3. לשתק את הזבובים על ידי צינון

  1. לשמור על refreezable icepacks קשה ב-20 ° c מקפיא לפחות 24 שעות לפני השימוש.
  2. מניחים מקורר, קשה מסכה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 20 דקות. מעט מויסטן פיסת גזה רפואי שאינה אספספיגה עם כמה מים זורמים ולאפשר לו להיאחז היטב את פני השטח של מסכה. גזה רפואי ניתן לעשות שימוש חוזר הזבוב הבא מצמרר. באותו זמן, לצנן בקבוקון ריק בקרח כתוש.
  3. העבר זבובים מבוגרים כי צריך להיות מקיבוע לתוך הבקבוקון הריק מקורר (CEV). כאשר שני מבחנות העברה מופרדים, לכסות את CEV עם צלחת פטרי או תקע ולהפיל את CEV נגד קרח כתוש כדי להקיש על כל הזבובים CEV למטה לתחתית. חזור על תהליך זה מספר פעמים עד שכל הזבובים יהיו ללא תנועה. . הזבובים יהיו ללא קיבוע בתוך 30 שנות לאחר מכן, הצב את ה-CEV בקרח במשך 1 דקות. לא מומלץ להעביר יותר מדי זבובים בבת אחת בשביל להיות מורדם.
  4. יוצקים את הזבובים מקורר אל גזה רפואי שמכסה את חבילת קרח. מורחים את הזבובים חופפים עם מכחול ולוודא כי כל זבוב יכול להיות מקורר על ידי המשטח הקר של icepack. אם מצוננים מצונן מתנפח מעט, מניחים אותו על מגבת ועובדים על הצד השטוח.
  5. להסיר את הסרטונים מstereomicroscope, לכסות את הבמה עם פיסת סרט פלסטיק, ולשים את מסכה על הבמה. הפעל את האור העליון (מקור אור קר רצוי), למקד את stereomicroscope ולהעביר את מסכה עד זבובים מקורר ניתן לראות בבהירות.

4. הריגת זבובים למבוגרים לספירה, מיון או השמטה

  1. להעביר מבוגרים זבובים לתוך בקבוקון ריק ולכסות אותו עם צלחת פטרי.
  2. להפוך את המבחנה, לחמם אותו עבור 1 דקות + 20 במיקרוגל, ולאפשר זבובים מתים לרדת לתוך צלחת פטרי.
  3. תלבש כפפות מגן ותוציא. את הבקבוקון מהמייקרוגל יוצקים זבובים מתים על כרטיס נייר לבן, לספור או לבחון את הזבובים עם מחט מיקרוסקופ מתחת stereomicroscope, ולהיפטר הגופות לעוף בפח אשפה לאחר התבוננות.
  4. כדי להרוג זבובים לא רצויים, לחמם את הזבובים 2 – 3 דקות במיקרוגל, ואז להקיש על הגוויות לתוך פח אשפה.
    הערה: לא מומלץ להרוג כמה זנים של מוטציות כנף (למשל, המוטנטים אורך הכנף) לבדיקה, כי קשה לשפוט מן הגוויות אם הכנפיים להאריך מעבר לקצה הבטן, אשר נראה זבובים מסוג פראי.

5. העברת זבובים פנימה/החוצה של בקבוקים בצורת כלוב אוסף ביצים

הערה: כפי שהוזכר לעיל, הפקקים T ו-F משמשים כדי להעביר זבובים לתוך ומחוץ לכלוב אוסף ביצים. זבובים לא צריכים להיות מורדם במהלך תהליך זה. פרטים נוספים, כגון הכנת מדיום מיץ התפוחים, אוסף הביציות והדבורנון, ניתן למצוא בספרות12.

  1. הכנס את הכלוב אוסף ביצים לתוך צלחת מיץ תפוחים או להר את צלחת מיץ התפוחים לכלוב עשוי בקבוק משקה רך. לאטום את המפרק סביב שני המרכיבים עם רצועת סרט הפרפין.
  2. מניחים כמו זבובים רבים ככל האפשר לתוך הכלוב ולחבר מחדש את הכלוב עם פקק קצף לאחר העברת הזבובים.
  3. כדי לשנות את המזון עבור זבובים בכלוב, להעביר את הזבובים בכלוב לבקבוקון ריק.
  4. להחליף את הצלחת מיץ תפוחים לאטום אותו, ואז להעביר את הזבובים מן המבחנה בחזרה לכלוב.
  5. כאשר אוסף הביצים מסתיים, להעביר את הזבובים לתוך בקבוקון ריק ולהעביר אותם לתוך בבקבוקונים התרבות.

6. ניקוי תרבית ומבחנות

הערה: באופן כללי, בקבוקון תרבות ישן מכיל זבובים חיים. בפרוטוקול המתואר כאן, זבובים אלה לא צריך להיהרג לפני הניקוי אלא אם כן הם זבובים הטרנסגניים.

  1. הסירו את כל דיו הסמן הקבוע מתוך מבחנות של תרבות זכוכית עם ספוגים רטוב נירוסטה.
  2. משרים את מבחנות התרבות במים זורמים.
    1. ממלאים כיור מעבדה עם מים, מוסיפים סבון נוזלי כלים למים ומערבבים.
    2. לטבול את מבחנות התרבות לתוך המים, ולאחר מכן להסיר את התקע, המאפשר למים לרוץ לתוך הבקבוקון. אבקת הכלים במים תגרום לשאר הזבובים הבוגרים לשקוע לתחתית ולטבוע במים.
    3. משרים את מבחנות התרבות הישנות במים לפחות 30 דקות.
  3. שחרר את הצ של התרגיל, הכנס את מברשת שפופרת הבדיקה והretighten את הצ. בדוק את כיוון בורר הסיבוב וודא שהתרגיל מסתובב בכיוון השעון. כוונן את הגורם המפעיל המהיר וודא שהמהירות המירבית נמוכה מ-500 סל ד.
  4. . נקה את בבחנות התרבות
    1. נקה את מבחנות התרבות בערך.
      1. שים כפפת גומי ארוכה על היד הלא דומיננטית והחזק את הבקבוקון במים.
      2. החזיקו את נהג מברשת השפופרת האלחוטי עם היד הדומיננטית החשופה, מחצי את המברשת לתוך בקבוקון התרבות וסוחטים את ההדק.
        הערה: אל טבול את הסוללה במים. המברשת המסתובבת תשבור את האוכל הישן, הגולם וכדומה, ותסיר יותר מ-95% מהפסולת.
      3. השליכו את הפסולת. לתוך פח אשפה נפרד חזור על תהליך זה עד שרוב הפסולת בכל בקבוקון נוקה.
    2. נקו את מבחנות התרבות ביסודיות.
      1. נקו את מברשת הצינורית, רוקנו ונקו את הכיור, וממלאים אותו במים נקיים.
      2. הסר את הפסולת הנותרת מכל בקבוקון תרבות כמתואר בסעיף 6.4.1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

T-ו-F הפקקים פותחו כקבוצה של כלים פשוטים שניתן להתאים ולהשתמש בכל לטוס העברת פעילויות. העברת זבובים מתרבות ישנה למספר תרבויות טריות כרוכה בהסרת אטמי הבקבוקונים הטריים, החלפתו בפקקים, ולאחר מכן הקשה על הזבובים בבקבוקון הישן, הסרת התקע במהירות והחלפתו בפקק T. אם האוכל הישן הוא קומפקטי, אז חשוב להפוך את הבקבוקון הישן להכניס את הקצה של הפקק T לתוך הפתיחה של מעצור F, ואז להקיש את הזבובים למטה לתוך בקבוקון טרי. לאחר מכן, החלפת הפקקים T ו-F וחיבור מחדש של הבקבוקונים מבוצעת. אם האוכל הישן הופך להיות פחות קומפקטי, מומלץ להפוך את הבקבוקון הטרי מעל, הר מעצור F כדי T-בפקק, ולאפשר זבובים לזחול לתוך הבקבוקון הטרי.

כדי להוסיף זבובים נוספים לצלב כבר מוכן, חשוב להקיש על זבובים במבחנה צלב למטה ולהחליף את התקע שלה עם פקק F. לאחר מכן, הנסבית חייב לבחון את הזבובים הצוננים מתחת לstereomicroscope, להרים זבוב מתוך הכנף באמצעות זוג מלקחיים מחודדים, ולאפשר לו להחליק לתוך הבקבוקון החוצה דרך גבעול המשפך. אם זבוב לכוד בגבעול של משפך, מומלץ לנשוף אותו בעדינות עם מפוח אוויר ולתת לו להחליק לתוך הבקבוקון. החלפת מעצור F וחיבור מחדש של המבחנה כאשר מספיק זבובים עבור הצלב נאספו אז נדרש. ה-T ו-F-פקקים הוכנסו ב 201013,14; עד כה, יותר מ 1,200 סטודנטים יש היתרון מתוך אלה לטוס העברת מכשירים. T-ו-F הפקקים הוצגו גם למדריכים וחוקרים באמצעות מדריך מעבדה15, אשר אומצה לשימוש במעבדות הוראה ומחקר.

שיטות הצינון הקיימות שונו לשימוש במחקר זה. תערובות קרח כתוש או מים קרח משמשות כדי לצנן את הזבובים בוגרים ולאחר מכן להעביר את הזבובים ללא קיבוע על פני השטח הקר של מסכה מכוסה עם פיסת גזה רפואי לא סטרילי. סיבי גזה לספוג את המים מרוכז ולשמור את הזבובים יבשים כאשר הם נבדקים. במקביל, את החורים הזעירים בין הליכי עיוות/weft לאפשר זבובים לגעת משטח קר של מסכה ולשמור אותם משותק (איור 2). בטמפרטורת חדר של 25 ° c, הטמפרטורה של פני השטח של מקורר, מסכה קשה עולה באופן דרמטי מ-19 ° צ' עד 2 ° צ' בתוך 20 דקות והוא מגיע לרמה כי הוא בטוח עבור הזבובים הישנים והחדשים מקווקו (איור 3). מסכה עובד די טוב בתוך המישור, ואת הזבובים מקורר להחזיר את התודעה בטמפרטורת החדר בתוך 30 s. מכיוון שהוא דק, הוא יכול להיות ממוקם תחת stereomicroscope כדי לבחון את הזבובים. מסכה קשה תיאר כאן עולה פחות מ $2; יתר על כן, 60 icepacks קשה עבור מחלקה של 100-150 סטודנטים בכל סמסטר שימשו, והם ניתנים לשימוש חוזר במשך שנים רבות. זו גרסה שונה של הטכניקה הרדמה מצמררת הוצגה בכיתה גנטיקה ספציפית לפני שלוש שנים, ואת החוסן שלה נבדק על ידי יותר מ 300 סטודנטים ואלה באוניברסיטאות אחרות.

זה כבר נמצא כי החימום הדיאלקטרי מיקרוגל הוא סוכן מהיר יותר נוח יותר להרוג זבובים למבוגרים (אם הם לא נחוצים עוד לאחר התבוננות) לעומת סוכנים כגון החידוש או הקפאה עמוקה (שולחן 1). החימום הדיאלקטרי מיקרוגל דורש זמן הרבה יותר קצר כדי להרוג זבובים מאשר משיכת יתר או קפוא עמוק. כל הזבובים מתים בתוך 80 s, כך לספור ולמיין קבוצה גדולה של זבובים בתוך פרק זמן קצר הוא אפשרי16. בהנחה כי הניסויים צריך להרוג זבובים 20x כדי לספור ולמיין אצוות לניסוי, זה ייקח 3 h + 20 דקות ו 5 h כדי להרוג את הזבובים על ידי היתר ומקפיא עמוק, בהתאמה; עם זאת, רק 27 דקות נחוצים באמצעות מיקרוגל.

בדומה לזבובים מתרחבים, זבובי המיקרוגל מרחיבים את הכנפיים בזוויות ישרות מהגופות. באופן כללי, לטוס גוויות שנהרגו על ידי המיקרוגל היו קלים באופן משמעותי מאלה שנהרגו על ידי אתר או מצמרר, אבל החום אינו מעוות את צורת הגוף, והגוויות לא הופכות לחדות או לטורפי. מאפיינים (לדוגמה, צבע גוף, צבע עיניים וצורת כנף) של זבובים במיקרוגל דומים לאלה שנהרגו באתר או בהקפאה (איור 4), ואין הבדלים משמעותיים במידות הכנף (שטח, אורך, רוחב) של זבובים שנהרגו בידי שלושת הסוכנים ( טבלה 1). לכן, ניתן להשתמש בגוויות של זבובים שנהרגו על ידי המיקרוגל לספירה, מיון ומדידה של תכונות מסוימות, כגון גודל כנף. הסקה מיקרוגל היא גם שיטה טובה להרוג זבובים לא רצויים ולהיפטר מהם בזמן. בנוסף, לטוס מורגוס (בקבוקים המכילים אתנול דליק, מתנול, או פתרונות סבון), אשר משמשים לאחסון זבובים מתים או מושלך, אינם נחוצים עוד במעבדות לטוס או שיעורי ביולוגיה3.

כלוב קטן של אוסף ביצים בצורת בקבוק תוכנן עבור פרוטוקול זה. באמצעות T-ו-הפקקים, מספר גדול של זבובים ניתן להעביר לתוך או מחוץ לכלוב, ואת הצלחות מיץ תפוחים בינוני ניתן לשנות בקלות רבה יותר. לבסוף, הזבובים אינם זקוקים להרדמה לפני ואחרי איסוף ביצים.

מנהל התקן של מברשת שפופרת אלחוטי ופרוטוקול לשימוש בציוד זה התפתח גם לצורך הפרוטוקול. מברשת שפופרת ממונעת באמצעות סוללה יכולה בקלות לשבור מזון וגולם ישנים המחוברים לבקבוקון תרבות זכוכית, ניתן לנקות בקבוקון בתוך 30 ס, והיעילות של הניקוי מוגברת מאוד; לכן, ניקוי כמויות גדולות של בבקבוקונים תרבות זכוכית כבר לא משימה מייגעת.

Figure 1
איור 1: כלים המשמשים בטיפול בדרוזוהילה. (א) המוצג הם כלי העברת זבובים ואת האביזרים הדרושים. הם (משמאל לימין) מפוח אוויר (משמש לפוצץ זבובים מבוגרים שנותרו בגבעול המשפך); הפקקים (מוכנס לבקבוקונים); ובקבוקון ריק מכוסה בצלחת פטרי (36 מ"מ, החצי התחתון של צלחת פטרי 40 מ"מ). הפקקים בקצף גדולים יותר מפתחי הבקבוקונים, כך שניתן להשתמש בהם בעזרת מבחנות של מידות פתיחה משתנה. הגודל המתואר כאן יכול להשתנות במידת הצורך. (ב) המוצגים הם חומרים הדרושים למחטים מיקרו. (ג) המוצג הוא מסכה קשה המשמש לצנן את הזבובים. (ד) המוצג הוא כלוב איסוף ביצים בצורת בקבוק (משמאל), תוכנית העיצוב שלה (באמצע), וכלוב ביצה פשוט שעשוי בקבוק משקה קל (מימין) (E) המוצג הם החומרים הדרושים עבור הנהג מברשת צינורית אלחוטיים. מברשת עגולה בצבע לבן שניתן לטעון לנהג המקדחה משמשת לניקוי מנות פטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זבובים מצוננים על פני השטח הקר של icepack. מי העיבוי נספג על ידי הגזה הרפואית, והזבובים הצוננים נשמרים יבשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: וריאציה של הטמפרטורה של משטח מסכה עם הזמן. הנתונים נאספו מחמישה העברות קשות, והטמפרטורות נמדדו בשני מיקומים במרכז icepacks עם מד חום אינפרא אדום על RT של 25 ° צ' ולחות יחסית של 29%. טמפרטורת המקפיא הייתה-24.5 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: השוואת גוויות מעופף שנרצחו במיקרוגל לאלה שנרצחו בידי אתיל-אתר וקיפאון עמוק. כאשר הגוויות העפות שנרצחו על ידי המיקרוגל נבדקו תחת הstereomicroscope, לא נמצאו מכשולים או עיוותים על הגופים, ולא נמצאו הבדלים בולטים בצבע הגוף, בצבע העיניים ובצורת הכנף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הריגת סוכןb הזמן ששימש להרוג זבובים משקל (mg/30 זבובים) כנף (mm או mm2)d
נקבה זכר נקבה זכר
אזורns אורךns רוחבns אזורns אורךns רוחבns
חום 1 דקות 20 36.60 ± 0.00 ac 22.65 ± 0.95 a 1.51 ± 0.16 2.30 ± 0.12 0.92 ± 0.05 1.20 ± 0.09 2.06 ± 0.08 0.83 ± 0.03
תירגע 15 דקות 41.20 ± 0.10 b B 25.70 ± 1.00 ab A 1.57 ± 0.15 2.37 ± 0.12 0.94 ± 0.05 1.23 ± 0.12 2.07 ± 0.10 0.84 ± 0.05
אתר 10 דקות 43.35 ± 0.85 b B 26.9 ± 0.70 b A 1.57 ± 0.16 2.36 ± 0.11 0.94 ± 0.05 1.18 ± 0.10 2.05 ± 0.10 0.83 ± 0.04
הדרוזופילה המבוגר מסוג פראי דרוזולה מלאנוגסטר. הם נתפסו בבייג, סין ושמרו במעבדה שלי במשך יותר מ 5 שנים, ושמרו על 25 ° c במדיום קמח תירס.
b החסכון המשמש הם חום: 1,300 W מיקרוגל תנור; קרירות: מקרר (-30 ° c); אתר: 2 מ"ל האתר, ואת הגודל הפנימי של האוויר הוא 170 mL.
c בתוך כל עמודה, משמעותו ואחריו המכתב זהה אינם שונים באופן משמעותי על ידי מבחן טווח מרובה של דאנקן, האותיות נמוך/עליון מציינים p = 0.05/0.01
d זבובים נבחרים באופן אקראי מתוך אותו בקבוקון תרבות. עשרים כנפיים של אותו מגדר נאספו מתוך זבובים שנהרגו על ידי אותו סוכן ושני כפילויות שמרו. תמונות דיגיטליות של כל כנפיים נלקחו וגודל כנף נמדד באמצעות ImagePro Plus תוכנה
ns: לא משמעותי ב p = 0.05

שולחן 1: ההשפעות של שלושת הסוכנים הורגים על משקולות הגווייה וגדלי כנף של מבוגרים דרוסופילה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מספר כלים תוצרת בית לטיפול בפעילויות בסיסיות הכרוכות בגידול בדרוזוהילה ובניסויים מתוארים במאמר זה. כלים אלה פשוטים אך יעילים למדי. כמעט, כל מעבדה יכולה לעשות את הכלים האלה בקלות, ומחקר או מעבדה להוראה לא צריך למצוא חלופה מוכנה שהיא אולי לא זמינה באופן מקומי.

העברת טיסה היא הפרקטיקה השכיחה ביותר ומשימה קשה בניסויי דרוזוהילה . למרבה הצער, עד היום, לא תוארו כלים העברת3,4,12,17 כאן, T-ו-F פקקים מתוארים. כלים פשוטים אלה להפוך את הזבובים הרבה יותר קל ומשליטה יותר, ופחות זבובים להימלט במהלך ההעברה, כפי שמעידים על כך העובדה כי כמה זבובים תועים נמצאו בכיתות גנטיקה בשנים האחרונות. כמו תקע הספוג הוא אלסטי, זה לא דורש כי הפתיחה של הבקבוקונים יש את אותו קוטר בפנים. בנוסף, מותר לזבוב אחד לעבור בפתח של עצת הפיפטה בכל פעם; משום כך, הפקקים מונעים מזבובים לקפוץ לתוך מבחנה, והניסויים יכולים לעצור בקלות את התהליך ולשלוט במספר הזבובים שהועברו. הפקקים יכולים גם למנוע מהאוכל הישן לצנוח לתוך בקבוקון טרי. הפקקים T ו-F קל לבצע ולהשתמש, ואפילו מטפל לא מנוסה יכול להשלים העברות לטוס במהירות ובקלות.

הפקקים משמשים להנחות. זבובים לתוך בקבוקון חדש הזבובים הבוגרים נוטים להיות משותף תחת הפקק ולא לברוח מן הגבעול של המשפך. זה עושה קצת עבודה קלה יותר לשליטה יותר (למשל, העברת זבובים ממבחנה אחת לאחרת או להוסיף זבובים בתולה נוספת או זבובים גברים לצלב מוכן). נמצא כי כאשר בקבוקון ממוקם במעבדה במשך זמן רב למדי (למשל, 1 h), רק זבובים מעט מאוד יברח מן הגבעול של המשפך.

במאמר זה מתוארת שיטת צינון אפשרית לביצוע זבובים. שיטה זו היא חלופה מצוינת לאתר ו-CO2 ניתן להשתמש הן מחקר והן מעבדות הוראה. שיטה זו ידידותית במיוחד למעבדת הוראה, משום שמדריך אינו צריך להיות מודאג מסיכוני בריאות פוטנציאליים לסטודנטים או לעשות מאמצים רבים לבניית שטח מיוחד יקר במעבדת הוראה צפופה. שיטה זו היא חסכונית, כמו icepacks הם זולים לשימוש חוזר. חוקר או תלמיד יכול לצנן ולבדוק זבובים בכל מקום, כמו זה "משטח קר" לא מתחבר לצינור כלשהו. שיטה זו אינה בטוחה רק לאנשים אלא גם לזבובים, מכיוון שהמערכת פועלת בטמפרטורות גבוהות מ-2 ° c. כל עוד הם נשארים על המשטח הקר ואינם נהרגים, הזבובים מתגלים בקלות. הזבובים מחזירים את התודעה במהירות ברגע שהם חוזרים לטמפרטורת החדר. אלה המחילים שיטה זו אינה דורשת תקופת הכשרה, ואין חששות בריכוזי הרדמה מוגזמת או לא מספיקים. עם זאת, ניסויים צריך לשים לב לגודל של icepack, כמו icepack בגודל קטן (g., 400-500 mL, ca. 19 ס"מ x 11 ס"מ x 2.5 ס"מ) אינם רצויים לטוס מצמרר מאז הם להתנפח כאשר הם קפואים וזה הופך מוזר לעבוד על משטחים.

כלוב אוסף ביצים בצורת בקבוקים פותח גם עבור הפרוטוקול. הניצול של הפקקים T ו-F, כמויות גדולות של זבובים לכלוב ניתן להוסיף או להעביר ללא צורך בשתק של הזבובים מראש. זה נמצא כי הסקה מיקרוגל היא דרך יעילה להרוג זבובים לבדיקה או להשליך. מכני עיפרון מבוססי מיקרולנתיחה המחט מבוססי מקדחה כלי ניקוי היו גם שימוש. כל הכלים האלה פשוטים ועובדים היטב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. לסופר אין מה לגלות

Acknowledgments

לא

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A pair of pliers
Cordless drill driver max speed: 500 rpm
Electric soldering iron
File
Funnel diameter of disk<60mm
Ice box
Insect pins
Infrared thermometer HCIYET HT-830
Long cuff rubber gloves
Mechanical pencils
Medical gauze
Microcentrifuge tube 100 ul
Microwave oven
Parafilm
Peri dish internal diameter 60 mm
Pipette tips 1 ml
Plastic film
Plastic Peri dish Φ36 mm used to cover the empty vial
Point tweezers
Protective work gloves
Re-freezable hard icepacks 26.5×14.5×2.5 cm or larger
Rubber air blower
Snap cutter
Soft drink bottle 500 ml, internal diameter c.a. 65 mm
Sponge stopper
Stainless steel sponges
Tube brush
Vial Φ34 mm × 90 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jennings, B. H. Drosophila – a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  2. JoVE Science Education Database. Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Drosophila melanogaster. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  3. Ashburner, M., Roote, J. Laboratory Culture of Drosophila. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 585-599 (2000).
  4. Greenspan, R. J. Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2004).
  5. Ashburner, M., Thompson, J. The laboratory culture of Drosophila. The genetics and biology of Drosophila. Ashburner, M., Wright, T. R. F. 2a, Academic Press. 1-109 (1978).
  6. Ratterman, D. M. Eliminating ether by using ice for Drosophila labs. Tested Studies For Laboratory Teaching. O'Donnell, M. A. , 259-265 (2003).
  7. Culturing techniques for Drosophila . , Available from: https://www.ptbeach.com/cms/lib/NJ01000839/Centricity/Domain/113/ap%20biology%20Labs/Culturing%20techniques%20for%20Drosophila.pdf (2019).
  8. Markow, T. A., O'Grady, P. M. Drosophila: A Guide to Species Identification and Use. , Academic Press. (2006).
  9. Artiss, T., Hughes, B. Taking the Headaches Out of Anesthetizing Drosophila: A Cheap & Easy Method of Constructing Carbon Dioxide Staging. The American Biology Teacher. 69 (8), e77-e80 (2007).
  10. Qu, W. -H., Zhu, T. -B., Yang, D. -X. A Modified Cooling Method and its Application in Drosophila Experiments. Journal Of Biological Education. 49 (3), 302-308 (2015).
  11. Egg-laying cages for drosophila. , Available from: https://www.kisker-biotech.com/frontoffice/product?produitId=0H-19-17 (2018).
  12. Roberts, D. B. Drosophila: a practical approach. , 2nd edn, Oxford University Press. (1998).
  13. Tang, M., Peng, Q. -F., Yang, D. Two devices for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 45 (11), 49-50 (2010).
  14. Zhou, T. -y, Gan, J., Yang, D. Preparation of sponge plug and sponge plug based fly transferring device for Drosophila experiments (in Chinese). Bulletin of Biology. 46 (6), 49-50 (2011).
  15. Yang, D. Genetics laboratory investigation. , 3rd edn, Science Press. (2016).
  16. Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, (2018).
  17. Stocker, H., Gallant, P. Getting Started: An Overview on Raising and Handling Drosophila. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Humana Press. (2008).

Tags

ביולוגיה סוגיה 149 דרוזופילה העברת מבוגרים שיטות קירור הריגה בוגרים ניקוי בקבוקון תרבות אוסף ביצים
כלים ביתיים פשוטים לטיפול בזבובי פירות-<em>דרוסופילה מלאנוסטר</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, D. Simple Homemade Tools to… More

Yang, D. Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies—Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59613, doi:10.3791/59613 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter